鱼类等水产品因营养丰富,水分含量高,内源性蛋白酶活跃,易发生新鲜度降低和腐败变质。新鲜度是水产品的重要品质属性,直接决定了产品的最终价值。如何客观、准确评价水产品新鲜度一直是水产加工业的重要课题。水产品新鲜度降低是一个复杂的生理生化过程。其中,肌肉蛋白质的变化对水产品的新鲜度影响最为直接。近年来利用蛋白质组学技术来研究贮藏过程中的水产品品质的变化越来越多,但尚未有用于研究我国重要海水养殖品种—大菱鲆的品质研究和新鲜度评价的相关报道。鉴于此,本文在大菱鲆冷藏过程中新鲜度和肌肉蛋白质生化性质变化的研究基础上,建立了大菱鲆肌肉蛋白质的差异蛋白质组学研究平台,并利用该平台系统研究其冷藏过程的蛋白质的变化,筛选出新鲜度指示蛋白。旨在为冷藏大菱鲆新鲜度评价提供新的思路和理论依据,并从蛋白质角度揭示其品质变化的原因。具体研究结果如下:1.建立了评价冷藏大菱鲆的质量指数法(Quality Index Methods,QIM),结合TVB-N值、K值、质构、菌落总数值等指标综合评价冷藏大菱鲆的新鲜度。结果显示:QI值与贮藏时间之间呈较高的线性关系,回归方程为QI=1.175×days-0.395(R2=0.988),该方程对冷藏大菱鲆剩余货架期的预测误差约为1天(0.816);贮藏15天时,QI值达18.28,各感官指标均达到感官拒绝期;此时,TVB-N值、K值和菌落总数值分别达到31.34 mg N/100g、72.24%和6.45 log cfu/g,均已经达到货架期终点的参考限定标准。QIM方法评价结果与鲜度指标具有良好的一致性,适用于大菱鲆货架期的研究和鲜度的快速评价,4℃冷藏大菱鲆的货架期为15天。2.研究了冷藏大菱鲆肌肉蛋白质的变化规律,发现在整个贮藏期,肌原纤维蛋白总巯基含量先上升后下降;盐溶性、Ca2+-ATPase活性均显著下降(P<0.05),表面疏水性、TCA可溶肽含量显著上升(P<0.05);SDS-PAGE电泳显示总蛋白中的条带Ⅰ(25-26 Ku),低盐溶蛋白中的条带111(41 Ku)、条带Ⅳ(38-39 Ku),高盐溶蛋白中的肌球蛋白重链(MHC)、肌动蛋白(Actin)、条带Ⅱ(37 Ku)等的光密度发生规律性升高或降低。TVB-N值、菌落总数均随时间显著增加,贮藏15天达到货架期终点。相关性分析表明:肌原纤维蛋白的盐溶性、表面疏水性、Ca2+-ATPase活性、TCA可溶性肽与菌落总数、TVB-N值均具显著相关性,可作为4℃冷藏大菱鲆新鲜度评价的辅助蛋白指标;低盐溶性蛋白中的条带Ⅲ、条带Ⅳ,高盐溶性蛋白中的MHC、Actin以及条带Ⅱ,总蛋白中的条带Ⅰ均与菌落总数、TVB-N值有显著的相关性,均有望作为冷藏大菱鲆的新鲜度指示物。3.建立并优化了大菱鲆肌肉蛋白质双向电泳技术,采取液氮研磨技术,结合裂解液Ⅲ得到的肌肉全蛋白样品,选用IPG预制胶条pH 4-7、上样量120μg在等电聚焦程序Ⅲ(50V主动水化16 h,500 V除盐1.5 h、1000 V除盐2 h及4000 V除盐2 h,8000 V升压1.5 h和 10000 V升压 1 h,10000 V 条件下聚焦 70000 vhr,500 V保持 10 h)以及 12%的 SDS-PAGE分离胶条件下得到具有高分离度的全蛋白双向电泳图谱,为定性研究冷藏大菱鲆贮藏过程中的新鲜度指示蛋白奠定基础。4.利用双向电泳的技术分析了大菱鲆在4℃ 15天贮藏过程中的肌肉蛋白质的变化规律,筛选出7个差异蛋白点,其丰度变化与贮藏时间、QI值、K值、TVB-N,TVC等鲜度指标呈显著线性关系,可作为冷藏过程中大菱鲆新鲜度指示蛋白。采用MALDI-TOF-MS得到肽指纹图谱,经数据库匹配分析得到6种蛋白,包括两种代谢酶(1-葡糖磷酸变位酶、丙酮酸激酶)以及四种结构蛋白(驱动蛋白-1重链、肌钙蛋白T、肌间线蛋白、肌动蛋白)。大菱鲆在4℃冷藏时肌原纤维蛋白结构和细胞骨架结构发生了显著的变化。在缺氧条件下,主要发生糖酵解作用,随着能量代谢的逐步减弱,参与糖酵解的酶类(1-葡糖磷酸变位酶和丙酮酸激酶)被消耗。同时由于内源性蛋白酶的作用,肌肉细胞骨架发生崩解,结构蛋白中驱动蛋白-1重链和肌动蛋白含量增加,肌钙蛋白T和肌间线蛋白含量降低。因此,本研究筛选的新鲜度指示蛋白与肌肉糖酵解和蛋白酶降解途径密切相关,这为解释大菱鲆贮藏过程中品质变化机制提供了证据。