论文部分内容阅读
目的：1.构建大鼠CREB结合蛋白(CREB binding protein, CBP)基因RNA干扰重组慢病毒载体,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs) CBP表达的沉默效应；2.探讨慢病毒介导的CBP基因沉默对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)诱导的大鼠VSMCs增殖的抑制作用及其分子机制；3.探讨慢病毒介导的CBP基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生内皮化的影响及潜在机制。方法：1.设计合成4条CBP基因的siRNA序列,将筛选确定的CBP RNAi有效靶序列与pFU-GW-iRNA载体连接产生CBP shRNA慢病毒表达载体,转化、PCR筛选阳性克隆及测序鉴定。脂质体2000将CBP shRNA慢病毒载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的重组慢病毒感染大鼠VSMCs, Real-time PCR检测CBP mRNA的表达,并与未转染及转染阴性对照shRNA (Negative control shRNA, NC shRNA)慢病毒的细胞进行比较。2.采用组织贴块法体外培养大鼠VSMCs,取3-8代细胞进行实验。以AngⅡ(100nmol/l)作为刺激因素,以不同感染复数(Multiplicity of infection, MOI=100、150)的CBP-shRNA/Lenti作为干预因素,通过BrdU掺入法评估各组VSMCs增殖情况；以Real-time PCR检测CBP、TNF-α及IL-6 mRNA表达；免疫沉淀/Western blot分析CBP、NF-κB p65蛋白的表达；荧光素酶报告基因分析NF-κB p65的转录活性；电泳迁移率实验(EMSA)检测NF-κB p65的DNA结合活性；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定TNF-α及IL-6的分泌。3.健康雄性SD大鼠随机分为4组：Sham组、PBS组、CBP-siRNA/Lentivirus转染组及NC-siRNA/Lentivirus转染组,建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,术后28d处死动物。激光共聚焦显微镜观察慢病毒动脉壁的转染效果；分别用Real-time PCR、Western blot检测大鼠颈动脉CBP和乙酰化核因子-κB p65 (NF-κB p65)的表达水平；病理组织学观察血管内膜增生情况；免疫组织化学染色对损伤血管壁增殖细胞核抗原(PCNA)、CD31的表达进行评估；伊文思蓝染色法评估内皮再生情况。结果：1.PCR扩增和测序结果证实,成功构建大鼠CBP shRNA慢病毒载体。经包装产生的慢病毒滴度为2×109TU/ml,与未转染慢病毒及转染NC shRNA慢病毒的细胞比较,CBP shRNA慢病毒转染可使VSMCs的CBP mRNA分别下降88.5%、92.7%。2. CBP-shRNA/Lenti剂量依赖性抑制AngⅡ诱导的CBP表达,MOI=150使VSMCs CBP mRNA和蛋白质的表达下调至正常水平以下(P<0.05)；CBP基因沉默显著抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖及相关细胞因子(TNF-αIL-6)的分泌,但是这种抑制效应没有随着MOI值的增加而增强(P>0.05); CBP-shRNA/Lenti转染明显下调AngⅡ诱导的NF-κB p65转录活性(P<0.05),但对NF-κB p65的核转位及DNA结合活性无影响(P>0.05)。3.重组慢病毒可稳定、高效转染血管壁；术后28d,与PBS和NC-siRNA/Lenti组比较,CBP-siRNA/Lenti转染使CBP mRNA与蛋白的表达显著下调(P<0.05)；CBP沉默能明显抑制新生内膜面积、内膜和中膜面积比的增加,及下调血管壁乙酰化NF-κB p65和PCNA的表达水平(P<0.05)；CD31免疫组化及伊文思蓝染色结果证实,CBP-siRNA/Lenti转染能明显促进球囊损伤血管的内皮化(P<0.05)。结论：1.成功构建CBP基因RNAi重组慢病毒表达载体,对体外培养的大鼠VSMCsCBP表达具有良好沉默作用。2.慢病毒介导CBP基因沉默可抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖,其分子机制主要是通过下调NF-κB p65的转录活性,从而导致增殖相关的细胞因子TNF-α/ IL-6分泌减少来实现。而这一调节机制与抑制NF-κB p65的核转位及DNA结合活性无关。3.慢病毒介导CBP基因沉默能抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生及促进血管内皮化,其分子机制与下调NF-κB p65的乙酰化有关。