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目的:探索优化大鼠肾脏脱细胞支架的制备,初步探讨hucMSC复合大鼠肾脏脱细胞支架防治慢性纤维化的作用及其机制。方法:1.取SD大鼠肾脏在不同流速下分别以SDS灌注(S组),Triton X-100联合SDS灌注(TS组)和冻融后Triton X-100联合SDS灌注(FTS组),制备肾脏脱细胞支架。HE染色、DAPI染色和DNA定量检测各支架脱细胞程度,Masson染色、PAS染色和免疫组织化学染色检测各支架主要成分保留和结构完整,扫描电镜检测各支架超微结构,MTT法检测各支架细胞毒性,ELISA检测各支架中生长因子的含量。2.将hucMSC经肾动脉和输尿管灌注大鼠肾脏脱细胞支架。HE染色观察hucMSC在支架上的分布,免疫荧光染色检测PCNA的表达。SD大鼠随机分为4组,分别行假手术切口(Sham组),5/6肾切除(STN组),5/6肾切除基础上移植脱细胞肾支架(DKST组)和hucMSC复合脱细胞肾支架(RKST组)。于8周后检测各组大鼠血肌酐、尿素氮,HE染色和Masson染色观察残肾纤维化程度,免疫荧光染色检测残肾EMT,Western blot检测TGF-β/Smad信号通路相关分子TGF-β1、p-smad2/3、Smad7和EMT标志物E-cadhein、α-SMA的表达。结果:1.FTS组脱细胞用时较少,HE染色和DAPI染色显示各支架无细胞残留,DNA含量<50 ng/mg。Masson染色和PAS染色可见细胞外基质中网状胶原及多糖,免疫组织化学染色可见Collagen I、CollagenⅣ、Fibronectin和Laminin表达。扫描电镜见各支架表面光滑,呈蜂窝状结构。MTT法检测支架细胞毒性分级为1级。ELISA检测提示FTS组支架中VEGF、EGF、IGF-1、PDGF-BB含量明显高于S组和TS组。2.hucMSC复合脱细胞肾支架HE染色发现肾小球和肾小管区域均存在细胞分布,且肾小管区域形成类肾小管结构,免疫荧光染色可见支架上部分hucMSC存在PCNA表达。移植后8周,与STN组相比,RKST组大鼠血肌酐和尿素氮降低,HE染色和Masson染色可见残肾炎症和纤维化程度减轻,免疫荧光染色发现E-cadherin和α-SMA的共表达减少,Western blot检测到E-cadherin表达增加,α-SMA表达减少,TGF-β1和p-smad2/3表达减少,Smad7表达增加。DKST组和STN组的肾功、肾纤维化程度、EMT标志物和TGF-β/Smad信号通路表达无明显差异。结论:1.冻融联合灌注法能够以低浓度、高效率制备大鼠肾脏脱细胞支架,该支架无细胞成分,细胞外基质中的胶原、多糖及主要结构蛋白得以保留,无明显细胞毒性,空间结构为蜂窝状,保留了更多细胞因子,为后期细胞复合提供了有利条件。2.hucMSC复合脱细胞肾支架可能通过TGF-β/Smad信号通路减轻肾小管EMT,从而改善肾纤维化。其中,hucMSC可能起到了关键作用。