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研究目的:先天性梗阻性肾病是小儿慢性肾病的常见病之一,是导致儿童终末期肾病的一个重要原因。输尿管梗阻后可以导致肾脏发生一系列的病理事件,包括间质巨噬细胞浸润,肾小管凋亡,随后发生间质成纤维细胞聚集。而肾脏间质成纤维细胞来源于局部成纤维细胞的增殖和肾小管上皮细胞间质转分化的发生,如果不能及时干预治疗,最终导致肾脏纤维化。因此,深入了解先天性梗阻性肾病的发病机制,早期干预和逆转肾脏损伤,具有重要的研究意义。此前课题组对前期手术治疗的肾盂输尿管交界处梗阻的不同分肾功能（＞4 0%和＜3 0%）的肾积水患儿肾实质标本进行全基因组测序,发现c i r c＿0 0 0 6 5 7 7在二组之间表达有明显差异。因此,本研究目的主要是检测c i r c＿0 0 0 6 5 7 7在T G F-β1诱导的肾小管上皮细胞及输尿管梗阻新生小鼠肾脏中的表达,并探讨c i r c＿0 0 0 6 5 7 7表达和体内外模型中肾小管上皮细胞发生上皮-间质转化以及凋亡之间的关系,分析c i r c＿0 0 0 6 5 7 7可能存在的功能作用。本研究拟从非编码R N A的角度在转录水平探索先天性梗阻性肾病肾损伤的发生发展机制,为早期诊断和治疗梗阻性肾病提供新的靶点。研究方法:1、肾小管上皮细胞EMT体内外模型的建立:体内模型:将育龄期C57BL/6雄鼠与雌鼠1:3合笼至雌鼠孕后单独分笼,待新生小鼠娩出后24 h-48 h内给予异氟烷麻醉后手术处理。实验分为SHAM组和UUO组两组,其中SHAM组作为对照组,左侧输尿管仅给予游离。UUO组新生小鼠给予左侧输尿管游离并结扎离断。分别于术后第5和14天取材。体外模型:使用TGF-β1（终浓度为10ng/ml）诱导人肾小管上皮细胞制备肾小管上皮细胞上皮-间质转化体外模型。使用含有10%FBS的DMEM/F12培养基培养于37℃5%CO2无菌孵箱中。2、q RT-PCR检测肾小管上皮细胞上皮-间质转化体内外模型中circ＿0006577的表达水平。3、Western blot检测SHAM组及UUO组肾脏组织中上皮-间质转化标志物E-钙蛋白（E-cadherin）和α-SMA、凋亡标志物BCL-2和BAX的表达,HE染色及MASSON染色检测SHAM组及UUO组肾脏组织形态学改变。4、运用RNA干扰技术（si RNA）将si-circ＿0006577转染至TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞中,敲低circ＿0006577表达,q RT-PCR检测在阴性对照nc+TGF-β1组与实验干扰si+TGF-β1组中circ＿0006577的表达水平,western blot及细胞爬片免疫荧光检测在阴性对照nc+TGF-β1组与实验干扰si+TGF-β1组细胞中上皮-间质转化标志物E-钙蛋白（E-cadherin）和α-SMA、凋亡标志物BCL-2和BAX的表达。5、利用si RNA敲低TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞中circ＿0006577表达,通过CCK-8实验,分别观察在阴性对照nc+TGF-β1与实验干扰si+TGF-β1组中人肾小管上皮细胞的增殖能力。6、利用TGF-β1（终浓度为10ng/ml）诱导人肾小管上皮细胞发生上皮-间质转化,以及利用si RNA敲低TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞中circ＿0006577表达,分别通过q RT-PCR和western blot技术检测RSU-1 m RNA及蛋白的表达水平。7、数据分析:实验结果以平均数±标准差表示,采用Graph Pad Prism 8.0进行数据分析,P＜0.05具有统计学意义。结果:1、PCR结果显示,与对照组相比,TGF-β1诱导48 h、96 h、144 h组中circ＿0006577表达水平均较对照组升高（P＜0.05）;RNase R消化实验显示:circ＿0006577呈环状或套索状结构。2、PCR结果显示,与同一天数SHAM组相比,UUO组第5天和第14天circ＿0006577表达上调。3、Western blot结果显示,与同一天数SHAM组相比,UUO组中E-cadherin及BCL-2表达下调（P＜0.05）,α-SMA及BAX表达上调（P＜0.05）。HE染色结果显示UUO组肾脏组织结构紊乱,肾小管严重变形及肾单位减少。MASSON染色结果显示,与SHAM组相比,UUO组肾脏纤维化程度明显增加。4、运用RNA干扰技术敲低TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞中circ＿0006577的表达,western blot及细胞爬片免疫荧光试验结果显示:与nc+TGF-β1组相比,si+TGF-β1组细胞中E-cadherin及BCL-2表达上调（P＜0.05）,α-SMA及BAX表达下调（P＜0.05）。5、通过si RNA技术沉默TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞中circ＿0006577的表达,CCK-8结果显示,与nc+TGF-β1组相比,转染si-circ＿0006577 48 h后可明显抑制细胞增殖率（P＜0.05）。6、与对照组相比,TGF-β1诱导48 h、96 h、144 h人肾小管上皮细胞组中RSU-1 m RNA及蛋白表达水平均较对照组升高（P＜0.05）;通过si RNA技术敲减circ＿0006577表达,经q RT-PCR和western blot检测:与nc+TGF-β1组相比,si+TGF-β1组细胞中RSU-1 m RNA及RSU-1蛋白表达均下降（P＜0.05）。结论:circ＿0006577在肾小管上皮细胞上皮-间质转化体内外模型中均存在差异性表达上调。此外,敲低circ＿0006577可抑制人肾小管上皮细胞的上皮-间质转化、凋亡、增殖过程。沉默circ＿0006577后RSU-1mRNA的表达也呈下调趋势。提示circ＿0006577可能参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT发生发展,并正向调控RSU-1 m RNA的表达。