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目的:肿瘤过继免疫治疗主要是通过在体外诱导活化和扩增自体或异体免疫效应细胞,并回输至患者体内,达到提高患者抗肿瘤能力的目的。然而,如何有效的活化与扩增效应细胞一直是研究难点之一。我们实验室自主分离纯化的红桂木凝集素（Artocarpus lingnanensis lectin,ALL）前期研究中发现ALL体外对人外周血淋巴细胞具有极强的活化和扩增作用,但由于体外细胞存活时间不长,限制了细胞过继回输治疗。白细胞介素2（Interleukin-2,IL-2）是一种免疫刺激性细胞因子,是维持体外淋巴细胞存活的关键性因子。因此,如何将ALL与IL-2联合应用于外淋巴细胞的扩增,将可能解决淋巴细胞体外扩增培养中存活时间短的难题。同时,ALL在体内是否可独自直接影响淋巴细胞比例和机体抗肝癌功能还未见相关报道。因此,本研究拟体外探索ALL联合IL-2对人外周血和鼠脾淋巴细胞活化及扩增效率,以及对不同淋巴细胞亚群比例的影响,体外探究经ALL联合IL-2刺激后的淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤力;体内条件下,探究ALL单独用药治疗荷肝癌小鼠对肿瘤生长的抑制作用,分析ALL对体内免疫细胞亚群增殖和细胞比例的影响。方法:1.探索ALL最适作用浓度将课题组新鲜分离纯化保存的ALL溶解,红细胞裂解法分离人外周血和鼠脾淋巴细胞,使用不同浓度ALL、IL-2刺激鼠脾淋巴细胞,CCK8法检测ALL、IL-2刺激鼠脾淋巴的适宜刺激浓度。2.检测ALL联合IL-2刺激淋巴细胞的增殖情况CCK8法和CFSE法检测ALL联合IL-2刺激后,人外周血和鼠脾淋巴细胞的增殖情况,流式细胞术检测刺激后细胞的凋亡率;设立IL-2刺激作为对照组。3.流式细胞术检测ALL联合IL-2刺激淋巴细胞活化情况和亚群变化流式细胞术检测ALL联合IL-2刺激后,T淋巴细胞活化标志因子CD69和CD25的表达情况,CD3+T细胞、B220+B细胞、CD49b+NK细胞、CD11C+DC细胞、（CD3+CD45RA-CCR7+）Tcm细胞、（CD3+CD45RA-CCR7-）Tem细胞和（CD3+CD45RA+CCR7+CD62L+CD95+CD122+）Tscm细胞比例的变化;设立IL-2刺激作为对照组。4.分析ALL活化淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用收集鼠Hepa1-6肝癌细胞（靶细胞）与经过ALL联合IL-2活化的鼠脾淋巴细胞（后续简称活化淋巴细胞）（效应细胞）共培养,CCK8法和LDH法检测效应细胞对靶细胞的增殖影响和杀伤作用。流式细胞检测共培养72h后,效靶比分别为20:1、10:1、5:1、1:1时靶细胞的凋亡率;以IL-2活化淋巴细胞、Hepa1-6细胞设立为对照组。5.检测活化淋巴细胞细胞因子分泌情况收集活化鼠脾淋巴细胞与鼠Hepa1-6肝癌细胞共培养的上清液,Elisa法检测共培养24-96h后,效靶比分别为20:1、10:1、1:1时,细胞因子IL-2、TNF-α和Gr B在不同效靶比上清中的浓度;以IL-2活化的淋巴细胞、Hepa1-6细胞设立为对照组。6.分析单独ALL治疗对荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫系统的影响在C57/BL6小鼠中建立鼠肝癌模型,于成瘤后第0,2,4,6,8天尾静脉注射ALL进行治疗,检测ALL治疗对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。分析ALL治疗后,小鼠外周血、脾脏和肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞及Tcm细胞、Tem细胞和Tscm、B细胞、NK细胞、MΦ细胞和DC细胞亚群的比例变化。Elisa法检测ALL治疗对模型小鼠血清中IL-2、TNF-α和GrB分泌水平的影响;以PBS设立为对照。结果:1.ALL体外对淋巴细胞增殖和抗肿瘤作用及不同免疫细胞亚群比例的影响1.1 ALL刺激鼠淋巴细胞最适宜浓度为10μg/mlCCK8结果显示ALL刺激鼠脾淋巴细胞后,细胞聚集成集落式生长,其中ALL浓度为10μg/ml时,对鼠淋巴细胞的刺激效果最好,刺激96h后细胞增殖率为34.19%±1.51,明显高于其余ALL（2.5μg/ml、5μg/ml和7.5μg/ml）刺激组（P＜0.05）,选定ALL浓度为10μg/ml进行后续实验。IL-2是维持鼠淋巴细胞体外生长的必需生长因子,且12.5ng/ml、25ng/ml和37.5ng/ml组细胞生长情况相近,差异无统计学意义,选定IL-2浓度为12.5ng/ml进行后续实验。1.2 ALL联合IL-2有效促进淋巴细胞增殖CCK8结果显示ALL+IL-2和IL-2组刺激鼠脾淋巴细胞96h后相对增殖率分别为98.98%±6.12和41.61%±2.78（P＜0.001）。CFSE染色流式细胞术检测结果显示ALL+IL-2、IL-2组分别刺激人外周血和鼠脾淋巴细胞72h后,绿色荧光有递减的现象,说明淋巴细胞出现分裂增殖;外周血淋巴细胞ALL、IL-2组细胞增殖比例分别为69.83%±3.17和55.73%±1.25（P=0.002）;鼠脾淋巴细胞ALL+IL-2、IL-2组细胞增殖比例分别为74.20%±2.50和61.43%±6.39（P=0.032）。流式细胞术检测ALL刺激72小时细胞的凋亡率,结果显示:ALL+IL-2组的凋亡率19.31%±0.97;而IL-2组和空白对照组的凋亡率为28.85%±0.93和30.32%±0.85,说明ALL联合IL-2刺激可促进淋巴细胞增殖且减少细胞凋亡,且增殖情况明显优于IL-2组（P＜0.05）。1.3 ALL联合IL-2有效促进T淋巴细胞活化流式细胞术检测显示ALL+IL-2组刺激鼠脾淋巴细胞24h后,早期活化标记CD69表达量为62.5%±2.45较IL-2组11.13%±0.21明显增高,且在后续的培养中持续高表达;T细胞晚期活化标记CD25表达量在培养48-72h时出现明显的升高,至72h时ALL+IL-2和IL-2组中表达量分别为50.46%±4.38和15.33%±0.71,说明ALL联合IL-2对T细胞具有更强的活化作用,CD69和CD25表达量明显高于IL-2组（P＜0.05）。1.4 ALL联合IL-2刺激对不同淋巴细胞亚群的影响流式细胞术检测ALL+IL-2组刺激人外周血淋巴细胞72h后,T细胞、DC和Tscm细胞的比例明显升高（P＜0.01）,B细胞、NK细胞比例却降低（P＜0.01）。ALL+IL-2组刺激鼠脾淋巴细胞72h后,B细胞、DC细胞、Tscm细胞和Tcm细胞的比例明显升高（P＜0.01）,而T细胞、NK细胞和Tem细胞的比例却降低（P＜0.01）。1.5 ALL+IL-2活化的淋巴细胞增强抗肝癌效应ALL+IL-2刺激活化的淋巴细胞按不同效靶比与鼠肝癌细胞共培养24-96h,CCK8结果显示活化淋巴细胞与肝癌细胞共培养组中肝癌细胞生长受到明显的抑制,且随着效靶比的增加,抑制作用逐渐增强（P＜0.05）,上清中乳酸脱氢酶（LDH）活性明显升高,效靶比为10:1和20:1时LDH活性远远高于其他各组（P＜0.05）。流式细胞术检测活化淋巴细胞与肝癌细胞共培养72h后肝癌细胞凋亡率,结果显示:ALL+IL-2刺激活化淋巴细胞组中肝癌细胞死亡率升高（P＜0.05）,且效靶比为10:1和20:1时细胞的死亡率最高。Elisa法检测活化淋巴细胞与肝癌细胞共培养上清中IL-2、TNF-α和Gr B在各效靶比组（E:T=1:1,E:T=10:1和E:T=20:1）的分泌水平,结果显示:随着效靶比增高,细胞因子分泌水平不断增加（P＜0.05）,且细胞因子水平均高于IL-2活化淋巴细胞组。2.ALL单独体内作用对肝癌生长及不同免疫细胞亚型的影响2.1 ALL单独治疗明显抑制小鼠肝癌生长12.5μg/g ALL和25μg/g ALL治疗组中荷瘤小鼠肿瘤体积增长明显受到抑制,而PBS组中小鼠肿瘤持续增长（P＜0.05）,但不同剂量ALL组之间差异无统计学意义。2.2 ALL治疗对肝癌小鼠外周血、脾脏和肿瘤浸润淋巴细胞中不同免疫细胞亚型的影响2.2.1 ALL治疗明显提高外周血中T细胞和Tem细胞的比例ALL高、低剂量组的小鼠外周血中T淋巴细胞、NK细胞及Tem细胞均升高,但是B淋巴细胞、MΦ细胞和Tcm细胞比例却明显降低（P＜0.001）,ALL高剂量组中DC细胞比例有升高趋势。2.2.2 ALL治疗提高脾脏中B、DC和Tem细胞的比例ALL高、低剂量组的小鼠脾组织中B淋巴细胞、DC细胞和Tem细胞比例均呈升高趋势,而T淋巴细胞、NK细胞、MΦ细胞和Tcm细胞比例均呈降低趋势。2.2.3 ALL治疗提高肿瘤浸润淋巴细胞中T、B和Tem细胞的比例ALL高、低剂量组的小鼠中肿瘤浸润淋巴细胞中特异性免疫T淋巴细胞、B淋巴细胞和Tem细胞的比例均有升高的趋势,而非特异性免疫细胞NK、MΦ细胞和DC细胞的比例均有降低的趋势。2.3 ALL治疗诱导荷肝癌小鼠分泌细胞因子IL-2、TNF-α和Gr BElisa法检测ALL治疗后肿瘤小鼠血清,ALL高、低剂量组中IL-2的浓度明显均高于PBS组（P＜0.001）,且ALL低剂量组中IL-2的浓度最高与高剂量组之间比较差异有统计学意义（P＜0.001）;ALL高、低剂量组中TNF-α的浓度均明显高于PBS组（P＜0.01）;ALL低剂量组中Gr B的浓度明显高于PBS组和高剂量组（P＜0.001）。结论:本研究在体外验证ALL联合IL-2对淋巴细胞具有活化和增殖作用,且能增强淋巴细胞抗肿瘤作用,利用ALL治疗可抑制小鼠肝癌模型中肿瘤的生长,提高外周血中T、B、DC细胞和外周血、脾脏和肿瘤浸润淋巴细胞中Tem细胞的比例,同时促进细胞因子IL-2、TNF-α和Gr B的分泌。