论文部分内容阅读
N-乙酰葡萄糖胺存在于所有生物体中,在人体中是透明质酸、硫酸软骨素及硫酸角质素等葡糖胺多糖的二糖单元前体。N-乙酰葡萄糖胺特异性地作用于关节软骨,对于维持软骨的健康和正常的关节功能具有重要作用；N-乙酰葡萄糖胺可以增加皮肤中透明质酸的含量；此外N-乙酰葡萄糖胺还是合成N-乙酰神经氨酸的前体物质。目前N-乙酰葡萄糖胺主要通过水解几丁质合成,化学法水解环境污染严重,水解几丁质的酶合成量低,不利于工业化生产。微生物发酵因其发酵周期短、产量高引起了越来越多的关注。我们在大肠杆菌中构建了N-乙酰葡萄糖胺的发酵途径。研究了以甘油为碳源时,N-乙酰葡萄糖胺的合成情况。利用不同启动子、不同拷贝数的质粒表达了N-乙酰葡萄糖胺合成的相关基因,发现在该发酵条件下低拷贝质粒中N-乙酰葡萄糖胺的产量最高。我们研究了manXYZ基因编码的甘露糖磷酸转运系统(EIIMan)转运N-乙酰葡萄糖胺的方向,结果表明该条件下甘露糖磷酸转运系统向胞内转运N-乙酰葡萄糖胺。敲除甘露糖磷酸转运系统基因之后,大肠杆菌利用甘油的速率大大加快。最后我们比较了以甘油或葡萄糖为碳源条件下N-乙酰葡萄糖胺的产量,发现葡萄糖更有利于N-乙酰葡萄糖胺的合成。N-乙酰神经氨酸,是神经氨酸家族中最常见的一种,广泛存在于自然界,是合成其他唾液酸的前体。N-乙酰神经氨酸通常位于细胞表面糖蛋白或者糖脂的末端,参与多种生理功能,如维持生物大分子的结构和功能、参与细胞和分子之间的识别和信号传递过程等。由于N-乙酰神经氨酸的重要生理功能,许多以N-乙酰神经氨酸为基础的药物被开发出来,如抗癌药物、抗粘附药物和抗病毒药物。其中抗病毒药物扎那米韦是N-乙酰神经氨酸的类似物,可以治疗和预防A型和B型流感病毒,根据最新的调查显示,目前已经出现了抗达菲的流感病毒变种,但是扎那米韦对这些病毒变种仍然有效。由于N-乙酰神经氨酸可以促进脑部发育,因此被添加于婴幼儿奶粉。N-乙酰神经氨酸的传统生产方法是从含量相对丰富的天然产物如燕窝、卵黄膜、乳清当中提取,但是这些天然产物中N-乙酰神经氨酸的含量较低,即使是N-乙酰神经氨酸的含量最高的燕窝中,也仅为67g/kg,加上提取工艺复杂,限制了N-乙酰神经氨酸的工业化生产。化学法合成N-乙酰神经氨酸需要经过多步保护和去保护的过程,最后产生消旋型N-乙酰神经氨酸,不利于实际应用。随着N-乙酰神经氨酸醛缩酶和N-乙酰葡萄糖胺异构酶的发现,酶法和全细胞催化合成N-乙酰神经氨酸的方法被开发出来,使得大规模合成成为可能。在酶法合成过程中,利用纯化的N-乙酰神经氨酸醛缩酶和N-乙酰葡萄糖胺异构酶,添加过量的前体物丙酮酸和N-乙酰葡萄糖胺,加入N-乙酰葡萄糖胺异构酶的激活剂ATP,合成N-乙酰葡萄糖胺。催化合成反应的酶可以重复利用,但是这个合成过程需要将两种酶纯化出来,在反应过程中还需要额外添加ATP, ATP不能重复利用且易于水解,增加了生产成本。全细胞催化利用整个细胞作为反应器,表达N-乙酰神经氨酸醛缩酶和N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶,催化反应在胞内进行,不需要进行酶的纯化。但是这一催化过程仍然需要添加前体物丙酮酸和N-乙酰葡萄糖胺,前体物价格比较昂贵。近年来,随着代谢工程和合成生物学的发展,人们通过分析和改造代谢途径,过量表达内源基因或引入外源基因,构建合成特定目标化合物的工程菌株并用于工业化生产。目前代谢工程在微生物合成萜类化合物、聚羟基脂肪酸酯、氨基酸、生物燃料等领域得到了广泛的应用。大肠杆菌因其易于培养、遗传背景清楚、遗传操作简便等优点被大规模应用于代谢工程改造合成各种有用的化合物。利用大肠杆菌以廉价碳源发酵合成N-乙酰神经氨酸的报道非常少。在本论文中,我们在大肠杆菌中设计了一条N-乙酰神经氨酸的发酵途径,以葡萄糖为碳源合成N-乙酰神经氨酸,为微生物发酵产生N-乙酰神经氨酸提供了新的思路。过量表达来自于Escherichia coli W3110的N-乙酰神经氨酸醛缩酶、来自于Synechocystis sp. PCC6803的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶,以及来自于Saccharomyces cerevisiae EBY100的葡萄糖胺-6-磷酸酰基转移酶,构建了一条以N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸为中间产物的N-乙酰神经氨酸合成途径。将这一代谢途径转入大肠杆菌DH5a,发酵获得少量N-乙酰神经氨酸。通过实时定量PCR分析,我们发现前体物N-乙酰葡萄糖胺合成途径的第一个酶葡萄糖胺-6-磷酸合酶基因表达量低,且此前研究表明该酶受其产物的反馈抑制,因此我们过量表达解除反馈抑制的葡萄糖胺-6-磷酸合酶基因,提高了N-乙酰神经氨酸的产量。通过阻断N-乙酰葡萄糖胺分解代谢支路,在大肠杆菌中检测到N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰甘露糖胺的积累,但N-乙酰神经氨酸的产量仅略有提高。分析重组菌株的发酵产物,发现乙酸是主要副产物。乙酸有两个主要来源：乙酰辅酶A经过磷酸转乙酰酶和乙酸激酶的催化生成乙酸；丙酮酸经丙酮酸氧化酶直接催化生成乙酸。乙酸的产生造成丙酮酸的浪费并且引起培养基pH下降,抑制菌体生长。敲除乙酸的两个主要产生途径,在发酵产物中同时检测到丙酮酸和N-乙酰葡萄糖胺的积累,并且N-乙酰神经氨酸的产量得到提高。在培养基中还检测到另一副产物乳酸的积累,敲除该支路后N-乙酰神经氨酸的产量进一步提高。大肠杆菌可以以N-乙酰神经氨酸为唯一碳源生长,我们阻断了N-乙酰神经氨酸的再利用途径,获得一株可以有效合成N-乙酰神经氨酸的重组菌株。将这一重组菌株进行补料发酵实验,得到7.85g/1N-乙酰神经氨酸,说明该菌株具有工业应用潜力。在发酵过程中还检测到有丙酮酸、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰葡萄糖胺,这些副产物在葡萄糖代谢完之后可以继续转化为N-乙酰神经氨酸。我们尝试了多种策略以改善发酵过程中N-乙酰葡萄糖胺积累较多这一现象。通过过量表达N-乙酰葡萄糖胺向胞内转运的基因,或者将N-乙酰葡萄糖胺合成基因在低拷贝质粒上表达,都可以引起胞外N-乙酰葡萄糖胺的量下降,但是N-乙酰神经氨酸的产量也随之降低。在发酵过程中添加表面活性剂以增加N-乙酰神经氨酸向胞外的转运,结果发现表面活性剂的添加引起菌体不同程度死亡,葡萄糖代谢能力下降或丧失,N-乙酰神经氨酸的产量也低于对照菌株。过量表达来自于大肠杆菌EV36的N-乙酰神经氨酸合酶,发现N-乙酰神经氨酸的产量低于N-乙酰神经氨酸醛缩酶催化时的结果。将大肠杆菌自身的N-乙酰神经氨酸合成途径中的基因过量表达,没有检测到N-乙酰神经氨酸的积累。我们利用微生物发酵合成N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰神经氨酸,为N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰神经氨酸的工业化生产提供了研究基础。