【摘 要】
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目的:应用分子生物学技术克隆大鼠生长相关蛋白(rat growth associated protein-43,rGAP-43)的基因片段,并以腺相关病毒(adeno-associated virus vector ,AAV)为载体构建出rG
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目的:应用分子生物学技术克隆大鼠生长相关蛋白(rat growth associated protein-43,rGAP-43)的基因片段,并以腺相关病毒(adeno-associated virus vector ,AAV)为载体构建出rGAP-43的表达系统,为进一步研究rGAP-43对大鼠视网膜中各类细胞的作用奠定基础,也为下一步进行基因治疗的研究提供实验依据。方法: 1.经RT-PCR法,获得SD大鼠脑组织的cDNA文库,设计引物,从中扩增出GAP-43基因的开放读码框区(open reading frame,ORF)基因片段,克隆入T载体,经DNA序列测定正确后,再大量扩增rGAP-43基因片段。2.同时将报告基因—绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein ,EGFP)经SalⅠ/BglⅡ酶切后连接上经同样酶切AAV-MCS多克隆载体,重组命名为AAV-EGFP,进行酶切鉴定与DNA序列测定。3.将目的基因rGAP-43经BamHⅠ/SalⅠ酶切后连接上经同样酶切的含EGFP报告基因的AAV质粒载体(AAV-EGFP)。重组表达质粒命名为AAV-EGFP-rGAP-43,随后针对重组表达质粒AAV-EGFP-rGAP-43进行酶切、DNA序列测定等结构上的鉴定。4.将重组表达质粒及AAV转染需要的辅助质粒pHelper、pAAV-RC经脂质体共转染入培养好的AAV-293细胞,进行荧光表达的检测以及病毒的包装、病毒原液的收集及病毒感染性滴度的测定等。结果:. 1.克隆出的rGAP-43基因的ORF区片段以及构建的AAV-EGFP-rGAP-43重组表达质粒,两者经DNA序列测定,所测序列与GeneBank检索的完全一致。. 2.重组表达质粒转染后的AAV-293细胞可检测到报告基因绿色荧光的表达,根据表达荧光的细胞数得到重组病毒的感染性滴度为106 particles/ml。结论: 1.应用分子生物学方法可以成功地克隆大鼠GAP-43基因并构建以腺相关
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