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目的:本研究以埃博拉病毒(EBOV)的扎伊尔型(ZEBOV)、苏丹型(SUDV)、塔伊森林型(TAFV)及莱斯顿型(RESTV)等四种亚型核蛋白(NP)的合成多肽为免疫原,利用杂交瘤细胞技术制备特异性单克隆抗体,为建立EBOV快速检测方法奠定基础。方法:利用DNAstar protean和BLAST等软件筛选埃博拉病毒四种亚型核蛋白优势抗原表位,人工合成抗原多肽与KLH偶联后免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性克隆,有限稀释法克隆得到特异性杂交瘤细胞。分别构建埃博拉病毒四种亚型核蛋白的重组质粒(pFlag-CMV-Z-NP、pFlag-CMV-R-NP、pFlag-CMV-T-NP、pFlag-CMV-S-NP),并转染到HEK293细胞,用Western blot检测四种带Flag标签的融合蛋白表达。最后以真核表达的埃博拉病毒核蛋白为抗原,用Western blot方法鉴定单克隆抗体的特异性。结果:通过DNAstar protean和BLAST筛选得到埃博拉病毒四种亚型核蛋白优势抗原表位(ZEBOV-NP,aa611-630:YRDHSEKKELP QDEQQDQDH;SUDV-NP,aa631-644:QGSESEALPINSKK;RESTV-NP,aa630-643:TSQLNEDPDIGQSK以及TAFV-NP,aa630-643:NQV SGSENTDNKPH)。人工合成抗原多肽后免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞技术最终获得了12株抗ZNP阳性杂交瘤细胞、6株抗RNP阳性杂交瘤细胞、6株抗TNP阳性杂交瘤细胞以及9株抗SNP阳性杂交瘤细胞。对33株单克隆抗体进行亚类测定,其中IgM型有4株,IgG2a型有3株,IgG2b型有5株,IgG1亚型有22株。间接ELISA测定各单抗腹水效价分别介于1:10~5~1:10~6。构建埃博拉病毒四种亚型核蛋白的重组质粒(pFlag-CMV-Z-NP、pFlag-CMV-R-NP、pFlag-CMV-T-NP、pFlag-CMV-S-NP),双酶切验证结果显示,得到了与目的片段长度相同的条带,序列测定结果与目的基因一致。将四种质粒转染HEK293细胞后,真核表达得到四种亚型的NP融合蛋白(Flag-ZEBOV-NP、Flag-RESTV-NP、Flag-TAFV-NP、Flag-SUDV-NP),经Western blot鉴定四种亚型的NP融合蛋白分子量大小介于100~120KDa。以真核表达的埃博拉病毒四种亚型核蛋白为抗原检测所制备单抗的特异性,Western blot结果显示,抗ZNP单抗(ZNP3F10、ZNP15F11、ZNP14E2)、抗RNP单抗(RNP9E5、RNP10C12、RNP15B12、RNP2A10、RNP7E7、RNP10F9)、抗TNP单抗(TNP1H3、TNP4B10、TNP10C1、TNP2A10、TNP8D3、TNP8G9)和抗SNP单抗(SNP11G9、SNP1G3、SNP12F12、SNP3F12)能够分别与Flag-ZEBOV-NP、Flag-RESTV-NP、Flag-TAFV-NP、Flag-SUDV-NP产生特异性反应,且与其它3种亚型NP无交叉反应。结论:本研究成功制备得到了抗ZNP,抗RNP,抗TNP及抗SNP的特异性单克隆抗体,为EBOV的监测、诊断提供了科学依据。