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背景目前冠心病的发病率逐年增加,已成为严重威胁人类健康的主要疾病之一。尽管冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting,CABG）和冠脉介入（percutaneous coronary intervention,PCI）治疗进展迅速,但仍有一部分患者由于弥漫性或完全性血管闭塞不适于常规血管成形术,或因为术后出现再狭窄、微小血管功能障碍等问题必须再寻求其他新的治疗途径。近年来研究发现,血管生长因子经安全有效的载体导入或直接注入缺血心肌,可以促进血管新生,为缺血性心脏病的治疗提供了新的策略。目前已知可能参与血管生成过程的调节因子包括:血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）、血管生成素（angiopoietin,Ang）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor,IGF）、单核细胞趋化蛋白-1（monocytechemotactic protein-1,MCP-1）等。大量动物实验和临床研究显示VEGF、FGF蛋白和基因可增加缺血心肌灌注、减小梗死面积、改善心功能,具备安全性、可行性。然而两者的Ⅱ期临床试验并没有取得预期的效果。血管新生是一个复杂的过程,需要多种生长因子和调节蛋白的参与,而且在血管新生的不同阶段,各种生长因子发挥的作用也有所不同。单个生长因子治疗不足以诱导成熟的血管新生。低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）作为细胞对缺氧适应性反应的上游关键性转录因子,通过对VEGF、PDGF、Ang、促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）、血红素加氧酶—1（heme oxygenase-1,HO-1）等多种靶基因的转录调控参与了血管新生、红细胞生成等病理生理过程。临床前期研究表明,应用具有组成型表达活性的HIF-1α基因治疗可诱导生理功能完整的血管新生。HIF-1α诱导的新生血管具有无明显炎症反应、不渗漏、不引起组织水肿的特点。因此HIF-1α被认为是最具有前景的促血管新生治疗的基因之一。缺血性心脏病HIF-1α基因治疗的优势在于:HIF-1α可以促进VEGF、Ang-1、Ang-2、Ang-4、PDGF、胎盘生长因子（placenta growth factor,PIGF）等多种基因转录促进血管新生,这些因子相互协调、相互拮抗,促进生理功能完整的血管新生,避免血管的过度增殖。其中VEGF是明确的受HIF-1直接调控的下游靶基因,可促进内皮细胞生长、增殖,增加血管通透性,使内皮细胞接受刺激因子的作用增加,血浆蛋白外渗,提供血管生成的最初环境并形成原始血管,对维持新生血管的存活具有重要作用;而Ang-1、PDGF能够招募血管周细胞,促进新生血管的成熟和稳定;Ang-4在血管成熟期对维持血管完整性、稳定性方面也可能起重要作用;Ang-2通过拮抗Ang-1而防止血管过度增殖。PlGF与VEGF具有协同效应,可减少新生血管的渗透。HIF-1由α亚单位和β亚单位构成,其中HIF-1β是结构性亚基,在细胞内的表达水平相对稳定;HIF-1α是功能性亚基,其蛋白稳定性和转录活性主要受细胞内氧浓度的调节。只有α,β亚基结合成二聚体HIF-1才有活性,HIF-1与目的基因的缺氧反应元件（hypoxia response element,HRE）结合促进其转录。HIF-1α表达及活性调节涉及多水平,其中最主要的是其蛋白稳定性和转录水平的调节,而这两种调节主要是氧依赖调节机制。常氧状态时,在脯氨酸羟化酶1,2,3（prolyl hydroxylase domain,PHDs1-3）的作用下,HIF-1α氧依赖降解结构域（oxygen-dependent degradation domain,ODDD）的402和/或564位点的脯氨酸残基被羟化,与von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白（pVHL）结合,经泛素蛋白酶途径降解。缺氧条件下,HIF-1α降解受阻,向细胞核内转移,与HIF-1β结合成HIF-1分子,与靶基因的HRE结合,激活靶基因的转录。为在常氧状态下使HIF-1α能高表达,2001年Mircea Ivan等将HIF-1α的Pro564定点突变为丙氨酸（Ala）发现其ODDD区与pVHL的不能结合,突变型HIF-1α较之野生型稳定而不容易降解。Panu Jaakkola等将Pro564突变为甘氨酸（Gly）,也得出类似的结果。Norma Masson等分析了Pro564及Pro402这两个位点突变型HIF-1α的表达情况,将它们分别突变为Gly564及Ala402后,发现这两种单突变型HIF-1α在常氧状态下都可以得到表达,蛋白水平大约相当于低氧状态下一半水平,而双突变型HIF-1α则近乎是一种组成型表达,即其常氧状态下的蛋白表达水平与野生型HIF-1α在低氧状态下的表达差不多。同时常氧条件下羟化酶还可以作用于HIF-1α转录激活区（C-TAD）803位点的天冬酰胺残基（Asn803）,通过HIF-1α抑制因子（factor inhibiting HIF-1α,FIH）抑制HIF-1α与辅助激活因子（CBP/P300）结合,从而抑制其转录活性。如果通过将Asn803突变为Ala803,则C-TAD与CBP/P300在常氧状态下的结合不受影响,从而保持HIF-1α常氧下完全的转录活性。在此基础上,本课题组将HIF-1α的Pro564、Pro402、Asn 803三个位点进行定点突变,成功构建了腺病毒介导的三突变HIF-1αAd-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803（Ad-HIF-1α564/402/803）,使其在常氧下能够稳定高效表达。为进一步明确HIF-1α在调控血管新生中的作用及Ad-HIF-1α564/402/803的生物学效应,本实验将Ad-HIF-1α564/402/803转染体外培养的人微血管内皮细胞（hMVECs）,研究其对hMVECs增殖及VEGF蛋白表达的影响。目的为了深入研究HIF-1α基因在血管新生中的作用及Ad-HIF-1α564/402/803的生物学效应,本课题观察Ad-HIF-1α564/402/803是否能在体外培养的hMVECs稳定高效表达,内皮细胞增殖是血管新生的必要条件,通过研究Ad-HIF-1α564/402/803对hMVECs增殖及VEGF蛋白表达的影响,进一步了解HIF-1α对血管新生的影响。方法1、将本课题组构建的重组腺病毒载体Ad-HIF-1α564/402/803、Ad- HIF-1αnature、Ad-lacZ及空载腺病毒载体Ad-Null,在HEK293A细胞内大量扩增,经氯化铯梯度离心法纯化,用终点稀释法测定病毒滴度;提取纯化后病毒DNA,采用PCR法对三突变型HIF-1α基因进行鉴定。2、对hMVECsⅧ因子及CD31相关抗原进行免疫荧光检测;Ad-LacZ以不同转染复数（multiplicity of infection,MOI）转染hMVECs,X-gal染色测定转染效率;96孔板培养hMVECs,Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null以最佳MOI转染细胞,分别在转染后第1,2,3,4,5天用MTS方法检测不同病毒载体对细胞增殖的影响。3、Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null以最佳MOI转染hMVECs,分别在48h、72h、96h提取细胞总蛋白,Western blot方法测定不同时间HIF-1α蛋白及72h各组VEGF蛋白表达量。4、按MOI为25、75、100、150、300 pfu/cell,Ad-HIF-1α564/402/803转染hMVECs,72h后提取细胞总蛋白,Western blot方法测定HIF-1α及VEGF蛋白表达量。结果第一部分:在HEK293A细胞内扩增后获得重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-Null、Ad-HIF-1αnature、Ad-HIF-1α564/402/803,纯化后终点稀释法测得的滴度分别为2.0×1013,2.5×1014,1.6×1012,2.0×1021pfu/ml。重组腺病毒载体转染HEK293A细胞后24h即出现病变效应（cytopathic effect,CPE）。提取Ad-HIF-1α564/402/803 DNA,PCR检测HIF-1α基因得到预期的380bp、460bp、214bp的目的片段,且DNA测序结果符合预期。第二部分:hMVECsⅧ因子及CD31相关抗原免疫荧光染色均为阳性;Ad-LacZ以不同MOI转染hMVECs,X-gal染色显示MOI为75 pfu/cell时,转染效率趋于稳定。Ad-Null、Ad-HIF-1αnature、Ad-HIF-1α564/402/803转染hMVECs MTS检测不同病毒载体及时间均有显著性差异（P值分别为0.000）,且病毒载体与时间之间存在交互效应（F=13.956,P=0.000）,各组在第1天吸光度无显著性差异（F=2.151,P=0.134）;第2、3、4、5天各组均有显著性差异（P值均为0.000）;在3、4、5天,Ad-Null组吸光度与control组比较无显著性差异（P值分别为0.610,0.175,0.514）;Ad-HIF-1αnature组吸光度均显著高于control组（P值分别为0.001,0.000,0.001,0.000）;Ad-HIF-1α564/402/803组在不同时间点吸光度均显著高于Ad-HIF-1αnature组（P值分别为0.000,0.000,0.001,0.000）。各组在不同时间点HIF-1α蛋白表达不同病毒载体与转染时间均有显著性差异（P值均为0.000）,且两者存在交互效应（F=3.990,P=0.012）。不同组在同一时间点均存在显著性差异（P值分别为0.003,0.000,0.001）;在不同时间点Ad-HIF-1α564/402/803组HIF-1α蛋白表达水平均显著高于空白组及Ad-Null组（P均＜0.05）,Ad-HIF-1α564/402/803组与Ad-HIF-1αnature组在48h、96h蛋白表达无显著性差异（P=0.092,0.197）,Ad-HIF-1α564/402/803组在72h HIF-1α蛋白表达显著高于Ad-HIF-1αnature组（P=0.017）,且VEGF蛋白表达量高于其他组。随着MOI值的升高,HIF-1α和VEGF蛋白的表达水平呈逐渐增加的趋势,当MOI为300 pfu/cell时,蛋白表达水平较前下降。结论第一部分:本课题组构建的重组腺病毒载体Ad-LacZ、Ad-Null、Ad-HIF-1αnature、Ad-HIF-1α564/402/803扩增后能获得较高的滴度,且转染效率高,为下一步实验提供了保证。第二部分:Ad-HIF-1α564/402/803对hMVECs增殖效应较Ad-HIF-1αnature强,且HIF-1α蛋白表达水平高,可上调VEGF蛋白表达。