研究背景当前人口的快速增长是一个亟待解决的全球问题,据统计,截止至2050年,世界人口将超过10亿人次,因此寻找一种安全、有效、廉价、易接受的避孕方法对于全世界特别是发展中国家是十分迫切的。免疫避孕由于具有诸多优点,目前已成为男性避孕药具中具有广阔发展前景的研究方向之一。富含半胱氨酸分泌蛋白-1(Cysteine-rich secretory protein-1, CRISP-1)是一种由附睾头部上皮细胞合成分泌的雄激素依赖型糖蛋白,通过与卵子表面的互补位点相作用,参与精卵融合的一系列过程。研究表明重组CRISP-1蛋白和纯化的天然CRISP-1蛋白在多个动物模型中均可以引起特异性免疫应答反应,所产生的特异性抗体可通过调控精子的获能及影响精卵融合,从而影响生育效果,提示CRISP-1是一种具有广阔发展前景的避孕候选疫苗。除了传统的减毒、灭活疫苗及蛋白质亚单位疫苗外,另一种在体内针对精子蛋白产生免疫应答的方法,是直接将编码精子蛋白的质粒DNA注射至宿主体内,即DNA疫苗,但由于裸DNA带负电荷,难以通过脂质的细胞膜；在体内易被核酸酶降解而迅速清除,DNA疫苗免疫效果多不尽理想。壳聚糖是一种带正电荷的天然聚合物,无细胞毒性,且具有很好的生物相容性和生物降解性,近年来作为一种新的载体系统已经被成功的应用于基因的体内外转染,并有研究证实,壳聚糖与不同抗原一起给药时可起到协同作用,优化免疫效果。本研究以小鼠Crisp-1cDNA为靶基因,应用基因重组技术构建鼠真核表达质粒pcDNA3.1-Crisp-1,然后采用复凝法制备壳聚糖-pcDNA3.1-Crisp-1(CS/DNA)纳米复合物,对其相关物理学、生物学活性进行鉴定,并与裸质粒DNA疫苗,重组mCrisp-1蛋白疫苗比较其免疫避孕效应及安全性,为开发新型男性避孕疫苗奠定基础。研究目的1.构建真核表达质粒pcDNA3.1-Crisp-1;2.构建载Crisp-1DNA疫苗的壳聚糖纳米粒；3.评估真核表达质粒pcDNA3.1-Crisp-1的免疫避孕效应及壳聚糖纳米粒作为DNA避孕疫苗载体的有效性和安全性。研究方法1.采用基因重组的方法构建真核表达质粒pcDNA3.1-Crisp-1,行BamHI和HindⅢ双酶切鉴定和序列比对验证。采用脂质体转染法,将重组质粒pcDNA3.1-Crisp-1或空载体pcDNA3.1转染至COS-7细胞,48h后行RT-PCR和间接免疫荧光细胞化学法检测COS-7细胞中mCrisp-1mRNA和蛋白水平的表达。2.复凝法制备质粒浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的壳聚糖-pcDNA3.1-Crisp-1纳米粒(CS/DNANPs),紫外分光光度仪检测不同质粒浓度下DNA的包埋率。于透射电子显微镜(TEM)下观察纳米粒形态,用纳米粒度分析仪测定纳米粒的平均粒径、多分散度和zeta电位。1%琼脂糖凝胶电泳分析壳聚糖纳米粒与质粒的结合力及在核酸酶条件下壳聚糖纳米粒对质粒DNA的保护作用。然后将载Crisp-1DNA疫苗的壳聚糖纳米粒直接转染至COS-7细胞,与脂质体比较其细胞毒性,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)(?)口间接免疫荧光细胞化学法鉴定转染后mCrisp-1在COS-7细胞内的表达。3.将雌、雄性BALB/c小鼠分别随机分为5组：生理盐水组、pcDNA3.1空载体组、裸质粒pcDNA3.1-Crisp-1DNA疫苗组、CS/DNA纳米粒组和重组(?)nCRISP-1蛋白组。每只动物初次免疫及加强免疫总共免疫3次(分别记为0周、2周和4周),经股四头肌注射,每次接种DNA或重组mCRISP-1蛋白剂量为50μg。分别于每次免疫前一天及第一次免疫后2、4、6、8、10、12周行内眦静脉取血,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中Crisp-1抗体水平,(?)(?)estern blot和中和性试验检测小鼠血清中Crisp-1抗体的特异性。第三次免疫后2周,将各组雌、雄性小鼠分别与生育力正常的异性小鼠进行合笼,次日凌晨见阴栓视为交配成功,将雌鼠单独喂养,3周后观察各组小鼠的妊娠率和每窝产仔数。给药期间,密切观察小鼠有无过敏反应,局部炎性反应及中毒现象,在末次给药后8周,取各组小鼠重要脏器和生殖器官行病理学检查。实验结果1.重组表达质粒pcDNA3.1-Crisp-1经BamH I和Hind III双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳,得到1条约5.4kb的pcDNA3.1片段和约750bp的mCrisp-1片段,测序结果与mCrisp-1基因序列一致。转染后COS-7细胞RT-PCR结果显示重组质粒pcDNA3.1-Crisp-1转染组扩增出一条约750bp的特异性条带,而空载体组和空白对照组无特异性条带出现。间接免疫荧光细胞化学检测结果显示重组pcDNA3.1-Crisp-1质粒转染的COS-7细胞可见强烈的FITC标记的绿色荧光,空载体组和空白对照组未见绿色荧光。2.采用紫外分光光度仪检测壳聚糖纳米粒对不同浓度质粒DNA的包埋率,结果显示,三种浓度下质粒包埋率均达90%以上,但当质粒浓度为100μg/mL时,壳聚糖对质粒DNA的包埋率最高(94.09±0.17%),且与另两组相比差异具有统计学意义(p<0.05)。透射电子显微镜下观察发现CS/DNA纳米复合物形态较为规则,近球形,大小较均一,直径多在150-200nm之间,散在分布,分散性好。纳米粒度分析仪测定结果显示,纳米粒平均直径为189.3nm,多分散指数为0.459,粒径分布范围较窄。Zeta电位约为+0.2mV。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,壳聚糖与DNA疫苗结合后使质粒DNA完全阻滞于加样孔中,并可保护质粒DNA不受核酸酶降解。MTT试验结果显示CS/DNA纳米复合物组细胞存活率与裸质粒组相比无明显差异(p>0.05),但显著高于脂质体组(p<0.01)。将未处理的正常COS-7细胞和经不同方式转染pcDNA3.1-Crisp-1的COS-7细胞分别行间接免疫荧光检测,结果显示,无论是用脂质体Lipofectamine2000TM介导转染的COS-7细胞还是CS/DNA纳米复合物直接转染的COS-7细胞中均可看到明亮的绿色荧光,而未处理组和pcDNA3.1空载体转染组细胞未见绿色荧光,表明壳聚糖可有效的介导Crisp-1DNA疫苗在真核细胞中表达。qRT-PCR检测经不同方法转染后COS-7细胞中Crisp-1mRNA的表达水平,结果分析显示,空白对照组和pcDNA3.1空载体组未检测到Crisp-1mRNA表达,脂质体Lipofectamine2000TM组Crisp-1mRNA表达水平略高于CS/DNA纳米复合物转染组,但差异无统计学意义(p>0.05)。ELISA结果显示,无论是雌性还是雄性小鼠,生理盐水和pcDNA3.1(+)空载体均未诱导特异性Crisp-1抗体产生,而pcDNA3.1-Crisp-1免疫组小鼠均在初次免疫后2周即产生特异性抗体,抗体滴度显著高于空载体组和生理盐水组(p<0.05),并于末次免疫后4周达到最高峰,停止免疫后8周抗体滴度又逐渐下降。CS/DNA纳米复合物和重组mCRISP-1蛋白免疫小鼠血清抗体滴度显著高于裸质粒pcDNA3.1-Crisp-1免疫小鼠(p<0.05),但CS/DNA纳米复合物免疫组小鼠和重组mCRISP-1蛋白免疫组小鼠血清抗体滴度相比较,差异不具有统计学意义(p>0.05)。用Western blot法检测免疫后小鼠血清中Crisp-1抗体的特异性,结果显示,pcDNA3.1-Crisp-1、CS/DNA NPs和重组mCRISP-1蛋白免疫后的血清可与纯化的重组mCRISP-1蛋白反应,产生一条约36kDa的弱带和一条约32kDa的强带,并与天然的精子粗提蛋白反应后可形成一条约30kDa的特异性条带。而生理盐水、空载体pcDNA3.1免疫组及免疫前血清与重组mCRISP-1和天然精子粗提蛋白反应后均未见特异性条带产生。中和试验结果显示各组免疫后血清与重组mCRISP-1蛋白共同孵育,不能与重组(?)nCRISP-1蛋白和天然精子蛋白产生特异性反应。生育试验结果显示雌性小鼠各组妊娠率和平均每窝产仔数分别为：生理盐水组(100%,10.754±0.55),pcDNA3.1空载体组(90.9%,10.69±0.44), pcDNA3.1-Crisp-1组(45.5%,6.80±0.58), CS/DNA纳米复合物组(25%,4.00±0.57),重组mCRISP-1蛋白组(25%,4.33±0.33)；雄性小鼠各组妊娠率和平均每窝产仔数分别为：生理盐水组(100%,10.57±0.56),pcDNA3.1空载体组(100%,10.43±0.55),pcDNA3.1-Crisp-1组(40%,6.17±0.31),CS/DNA纳米复合物组(26.7%,3.75±0.48),重组mCRISP-1蛋白组(26.7%,3.75±0.25)。与生理盐水组相比,pcDNA3.1空载体组雌雄性小鼠妊娠率及平均每窝产仔数无明显差别(p>0.05),但其他三组雌雄性小鼠妊娠率及平均每窝产仔数均呈不同程度降低。尽管pcDNA3.1-mCRISP-1免疫组雌雄性小鼠生育率和平均每窝产仔数均显著低于生理盐水组(p<0.05)和pcDNA3.1免疫组(p<0.05),但显著高于CS/DNA纳米复合物组和重组mCRISP-1蛋白免疫组(p<0.05,p<0.05)。雌雄性CS/DNA纳米复合物和重组mCRISP-1蛋白免疫组小鼠生育率和平均每窝产仔数均无显著性差异(p>0.05)。雌雄性小鼠之间生育抑制率差异也无显著性意义(p>0.05)。给药期间,各组小鼠均未见明显异常。与对照组相比,免疫后各组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等重要脏器及生殖器官均未见明显病理性改变。结论本实验成功地构建了真核表达质粒pcDNA3.1-Crisp-1及壳聚糖-pcDNA3.1-Crisp-1纳米复合物。pcDNA3.1-Crisp-1DNA疫苗具有一定的生育抑制效果,但避孕效果不尽理想。壳聚糖纳米粒可显著提高pcDNA3.1-Crisp-1DNA疫苗的免疫效应,并具有良好的安全性。