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谷氨酸（glutamate,Glu）是哺乳动物中枢神经系统（CNS）中重要的兴奋性神经递质,参与中枢兴奋性突触传递。其介导的信号转导构成记忆和认知的基础,与突触可塑性、神经元生长与存活、长时程增强等重要生理过程有关。谷氨酸的过量释放导致NMDA受体的过度活化与许多慢性神经退行性病变,如阿尔茨海默病（Alzheimersdisease,AD）,帕金森病（Parkinsonsdisease,PD）等的发病及病程发展相关联。金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是广泛存在于生物体内的一类低分子量、富含半胱氨酸,可被金属诱导产生的细胞内金属结合蛋白。在脑组织中MT调节必需金属的内环境稳态和代谢,参与非必需金属的贮存和解毒、抗凋亡、清除自由基和调节细胞内氧化-还原平衡,从而具有神经保护作用。研究表明,MT影响AD等神经系统性疾病及脑损伤的发病过程,但是其确切机制尚不清楚。近年来,应用基因敲除技术建立的MT缺失动物模型为研究MT生物学功能及其作用机制提供了重要工具。本研究应用MT-Ⅰ/Ⅱ基因敲除小鼠（MT-/-）及相应野生型小鼠（MT+/+）,建立神经元-胶质细胞混合培养模型,研究MT表达水平对皮层神经元生长发育的影响,观察MT对NMDA致神经兴奋性毒性的保护作用,着重从氧化损伤与细胞凋亡等方面探讨MT对NMDA致神经兴奋性毒性的影响并探讨其可能的作用机制。为NMDA相关神经系统疾病及脑损伤的预防和治疗提供新思路和药物作用新靶点,为深入阐明MT的生物学作用提供实验依据。1金属硫蛋白缺失对神经细胞生长发育的影响采用MT-Ⅰ/Ⅱ基因敲除（MT-/-）小鼠及相应的野生型（MT+/+）小鼠为动物模型。采用镉饱和法测定脑组织中MT含量,确证动物模型可靠性。MT-/-小鼠及MT+/+小鼠皮层神经元-胶质细胞原代混合培养,采用免疫荧光化学法定位MT-Ⅰ/Ⅱ在神经细胞中的表达。分别在不同培养时间进行细胞固定,H.E.染色,观察两组皮层神经细胞的细胞突起率、突起数目、突起长度以及细胞胞体大小,分析MT-Ⅰ/Ⅱ的缺失对皮层神经细胞生长发育的影响。结果表明:①MT+/+小鼠全脑MT含量显著高于MT-/-小鼠,确证了该动物模型的可靠性;②MT-Ⅰ/Ⅱ在胶质细胞和神经元中均存在,呈弱阳性表达。胶质细胞中MT-Ⅰ/Ⅱ主要存在于细胞核内,神经元中MT-Ⅰ/Ⅱ存在于细胞胞质内,细胞核呈较弱荧光;③MT-/-小鼠皮层神经细胞随着培养时间的增长,在突起数目、突起长度、胞体大小均低于MT+/+小鼠,表明MT-Ⅰ/Ⅱ的缺失对皮层神经细胞的生长发育有抑制作用。2金属硫蛋白对NNNMMMDDA致神经细胞兴奋性损伤的保护作用本研究采用MT-/-小鼠及MT+/+小鼠皮层神经元-胶质细胞混合培养,给予NMDA受体激动剂N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）,建立NMDA皮层神经细胞损伤模型。观察细胞存活率、LDH漏出率的差异性,比较MT-/-小鼠及MT+/+小鼠皮层神经元-胶质细胞对NMDA引起的神经兴奋性损伤作用。采用Westernblot检测NMDA作用后MT-Ⅰ/Ⅱ的表达情况,评价NMDA对MT-Ⅰ/Ⅱ是否有诱导表达作用。NMDA受体的过度激活可导致胞内Ca2+超载,干扰线粒体电子传递导致活性氧自由基（ROS）的生成,引起细胞脂质过氧化、DNA损伤和细胞凋亡。为了证实MT-Ⅰ/Ⅱ的保护作用机制是否与阻断NMDA所致的上述病理性改变有关,本研究对上述指标及其相互关系进行了研究。细胞经NMDA处理后,采用Griess法检测培养上清液中NO含量;用相应的荧光探针（Hoechst33258、DCFH-DA、Fluo-3/AM、Rhodamine123）标记,检测细胞凋亡、ROS、[Ca2+]i,线粒体膜电位;采用TBAS比色法检测膜脂质过氧化程度;单细胞凝胶电泳检测DNA损伤。结果表明:①NMDA引起MT-/-小鼠及MT+/+小鼠皮层神经元-胶质细胞毒性损伤,以MT-/-小鼠的表现更为严重,其细胞存活率降低,LDH漏出增加,细胞凋亡增强,表明MT对NMDA引起的神经兴奋性损伤具有保护作用;②Westernblot结果显示,NMDA能诱导MT-I/II的表达升高;③MT的表达能抑制NMDA引起的活性氧（ROS和NO）的过量生成,抑制脂质过氧化产物MDA的生成,表明MT对NMDA引起的脂质过氧化损伤及DNA损伤有保护作用;④MT对NMDA引起的胞内Ca2+稳态失衡、线粒体膜电位降均有拮抗作用,表明MT-Ⅰ/Ⅱ通过抑制NMDA引起Ca2+超载及线粒体膜电位下降而对NMDA引起的神经兴奋性损伤起保护作用。本研究还发现,MT-/-小鼠与MT+/+小鼠的皮层神经元-胶质细胞在LDH漏出、培养上清液中NO含量、ROS检测、DNA损伤等指标上存在差异。表明MT-Ⅰ/Ⅱ的缺失导致皮层神经细胞在基础应激状态上存在差异,这也可能是MT-Ⅰ/Ⅱ缺失抑制皮层神经细胞生长发育的原因之一。综上所述,MT的缺失对神经元的生长发有一定的抑制作用,MT在神经细胞的生长发育过程中具有重要作用。MT通过拮抗NMDA-Ca2+-NO途径对NMDA诱导的神经兴奋性损伤发挥保护作用。