论文部分内容阅读
研究背景：结肠癌是常见的恶性肿瘤，在西方国家发病率（50/10万）与死亡率位居恶性肿瘤的前3位；在亚洲，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势；在我国，结肠癌的发病率仅次于胃癌、肺癌和食道癌，排名第4位，患者5年中位生存率不足40%。研究资料显示，我国结肠癌的发病率与死亡率将在今后很长一段时间内呈快速上升趋势，将成为常见而高发的恶性肿瘤。因此，深入探究结肠癌的发病机制，寻找有效的化学治疗药物己成为抗结肠癌研究重要而紧迫的任务。目前，普遍认为结肠癌发病是一个多基因、多环节的复杂过程，其中涉及多个癌基因激活和抑癌基因失活。p53是一个重要的抑癌基因，它主要通过调控下游基因发挥作用。p53蛋白可以促进p21和Bax基因的表达，引起细胞周期阻滞和凋亡发生。很多抗肿瘤药物通过p53依赖途径发挥作用，但是临床研究发现，有接近50%的肿瘤患者存在p53突变以及其功能缺失。曲古抑菌素A(TrichostatinA,TSA）是一种强效、特异而可逆的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以抑制多种肿瘤细胞生长，诱导细胞周期阻滞，促进细胞分化及细胞凋亡。尽管国内外对TSA的抗肿瘤作用已经进行了一些研究，但其抗肿瘤的作用机制仍然有待进一步阐明。本课题通过观察TSA对HCT116p53(+/+)和HCT116p53(-/-)结肠癌细胞，以及p53突变型结肠癌HT29细胞的细胞周期和细胞凋亡的作用，同时分析TSA对与细胞凋亡密切相关分子PAPP, caspase3、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MCL1和Ku70的调控作用，深入探究TSA引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡的机制。本课题的研究，将进一步丰富TSA的抗肿瘤作用机制，并为组蛋白去乙酰化酶抑制剂用于结肠癌的化学预防和治疗提供理论依据。目的：1．观察TSA对细胞周期、对细胞凋亡的影响，探讨p53依赖、非依赖途径在TSA引起细胞周期阻滞和细胞凋亡中的作用。2．通过检测TSA对Bax启动子活性的调控作用和对细胞凋亡相关分子PAPP、caspase3、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MCL1表达及线粒体膜电位的影响，深入探究TSA诱导结肠癌细胞凋亡的机制；3．通过检测TSA对Ku70乙酰化以及Bax转位的影响，阐明Ku70乙酰化在TSA诱导的结肠癌细胞凋亡中的作用。实验方法：实验一以HCT116p53(+/+)、HCT116p53(-/-)细胞及突变型p53基因的HT29细胞为研究对象，经过不同浓度（0、0.1、1、5μM）的TSA处理24h后，采用流式细胞仪测定细胞周期分布和细胞凋亡；启动子实验检测TSA对p21活性的影响；Westernblotting分析TSA对乙酰化p53和p21蛋白表达的影响。实验二以表达野生型p53基因的HCT116细胞的和突变型p53基因的HT29为研究对象，分别用不浓度（0、0.1、1、5μM）的TSA处理，以流式细胞仪和Westernblotting检测细胞凋亡；采用Mitotracker染料观察活细胞线粒体膜电位变化；Westernblotting方法检测细胞凋亡相关分子PAPP、caspase-3、Bax、Bcl-2、Bcl-xL和MCL1的表达；启动子实验检测TSA对Bax活性的影响；BaxsiRNA技术检测Bax表达水平和PARP剪切情况。实验三以表达野生型p53基因的HCT116细胞的和突变型p53基因的HT29细胞为研究对象，给予不同浓度（0、0.1、1、5μM）的TSA处理，采用免疫荧光染色法观察在不同的时间点（0h、1h、4h、18h）Ku70分布的变化；IP-Westernblotting方法检测TSA对Ku70乙酰化的作用；Westernblotting方法检测经TSA处理6h和18h后胞浆中和线粒体中Bax表达量的变化；Ku70siRNA技术检测Bax表达水平和PARP剪切情况。结果：实验一1．TSA可浓度依赖性地诱导HCT116p53(+/+)、HCT116p53(-/-)细胞及突变型p53的HT29细胞发生G2/M周期阻滞。2．TSA可浓度依赖性地增加p53阳性HCT116细胞的乙酰化p53和p21蛋白表达，同时促进p21启动子的活性；而TSA对p53阴性的HCT116细胞的乙酰化p53和p21蛋白表达及p21启动子激活无明显影响。3．TSA可浓度依赖性诱导结肠癌细胞凋亡，p53阳性细胞凋亡率显著大于p53阴性细胞。实验二1．TSA浓度依赖性诱导HCT116和HT29细胞凋亡，其中HCT116细胞凋亡率显著高于HT29细胞。2．TSA可浓度依赖性地降低两种细胞线粒体膜电位，同时浓度依赖性激活caspase-3。3．两株细胞经TSA处理后，Bax蛋白的表达均显著性增加而Bcl-2和Bcl-xL的表达均显著性减少，且呈浓度依赖性；TSA对两株细胞中MCL1蛋白表达均无显著性影响。4．p53阳性和阴性HCT116细胞经TSA处理后，其Bax的转录活性均浓度依赖性增高。5．p53野生型和突变型细胞经TSA处理后，Bax表达量和PARP剪切片段显著性增加；用BaxsiRNA使Bax表达下调后，PARP剪切片段显著性减少，表明细胞凋亡减少。实验三1．TSA处理HCT116细胞和HT29细胞1h后，部分Ku70由胞核向胞浆转位；4h开始再向细胞核中分布，到18h，胞浆中仍有少量Ku70，HCT116胞浆中的少量Ku70形成颗粒状。2．两株细胞经TSA处理后，乙酰化Ku70表达均显著性增加。3．两株细胞在TSA处理6h后，胞浆中Bax表达显著性减少而线粒体中表达显著性增加；18h后这种趋势更加明显；细胞色素C的表达与Bax恰好相反。4．用Ku70siRNA使两株细胞中的Ku70表达下调后，经TSA处理，Ku70、Bax表达量及PARP剪切片段均显著性减少。结论：1．TSA以浓度依赖性的方式诱导结肠癌细胞的G2/M期阻滞，这种阻滞作用不依赖于p53-p21途径。2．TSA以p53依赖和非依赖途径诱导结肠癌细胞凋亡，p53的正常功能对TSA诱导的凋亡有促进作用。3．TSA通过Bax依赖途径激活线粒体通路，诱导结肠癌细胞凋亡。4．TSA通过影响Ku70乙酰化诱导Bax依赖性凋亡。