龙眼果实XET基因的克隆、表达及调控分析

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龙眼为亚热带名优水果,常温贮藏及低温贮藏转移至室温下的果实果肉极易自溶,果肉自溶是制约龙眼贮藏期及货架寿命的重要原因之一。木葡聚糖内糖基转移酶(XET)通过解细胞壁成分之一——木葡聚糖而参与果实生长、发育、成熟及软化。本文以龙眼果实为材料,在克隆果实XET基因全长序列的基础上,研究XET基因在生长期果皮、果肉中及采后贮藏期间的果肉自溶过程中的表达特征;同时探讨植物生长调节剂NAA(Q—naphthaleneaceticacid,α-萘乙酸)和TDZ(Thidiazuron,苯基噻二唑基脲)对不同生长发育期的果实XET基因表达调控的影响,试图阐明龙眼果实生长发育及采后果肉自溶与果实XET基因表达的关系。研究结果表明: l、以龙眼果实的cDNA为模板,设计XET基因的兼并引物,采用RT-PCR并结合RACE方法,得到3个不同的XETcDNA的全长序列,分别命名为DI-XETl、DI-XET2和Dl-XET3,它们分别编码282,288和294个氨基酸。序列分析表明DI-XETl、Dl-XET2和Dl-XET3分别包含82bp,45bp和52bp的5’不翻译区域,149bp,184bp和149bp的3’不翻译区域。由XET核苷酸推导的氨基酸序列均含有XET蛋白所含有的保守氨基酸区域即:天冬氨酸一谷氨酸一异亮氨酸一天冬氨酸一苯丙氨酸一谷氨酸一苯丙氨酸一亮氨酸一甘氨酸(DEIDFEFLG)。 2、‘石硖’龙眼果实生长呈S形曲线。在花后56d,果肉生长迅速,此时果实重量急剧增加,果实迅速膨大,而果皮在果实的这个生长期均生长平缓。基因表达的分析表明,在龙眼果实整个生长期间DI-XETl在果皮中表达逐渐增强,但在果肉中,DI-XETl表达水平差别不明显,呈现组成型表达,说明DI-XETl与龙眼果皮生长相关而与果肉生长不相关;随着果皮及果肉的生长,DI-XET2的表达均增强,说明Dl-XET2与果皮及果肉的生长关系密切;而只是在快速生长期的果肉中才能检测到DI-XET3的表达,在果皮中没有表达,说明DI-XET3与果肉生长有关而与果皮生长没有关系。这些结果表明,DI-XETl和DI-XET2可能参与龙眼果皮的生长,而DI-XET2和DI-XET3在参与果肉生长中同时起作用。 3、常温(25℃,下同)下贮藏的龙眼果肉在第2d开始自溶,至第5d果肉几乎完全溶解。丙烯不能加速常温下贮藏的‘石硖’和‘储良’龙眼果实的衰老进程,并且丙烯处理不能调控常温贮藏龙眼果实XET基因的表达;低温(4℃,下同)贮藏后,果肉大约在贮藏30d后开始出现自溶,低温有效地延缓了果肉的自溶,但低温下贮藏30d的龙眼果实转移至常温下的货架期间,果实在24h内迅速腐败变质,丧失商品价值。 4、在常温贮藏阶段,DI-XETl,DI-XET2和DI-XET3这3个基因在‘石硖’和‘储良’两个品种中的表达没有差异。DI-XETl在常温贮藏的整个阶段都没有表达,DI-XET2受到丙稀的处理后表达减弱,DI-XET3的表达则随着贮藏时间的延长及果肉的自溶而逐渐增强。就‘石硖’龙眼而言,DI-XETl,DI-XET2和DI-XET3在低温贮藏期间的表达没有差异,而DI-XETl和DI-XET3的表达则随着果实从低温转向常温货架期间的果肉自溶而增强,说明DI-XETl和DI-XET3可能与‘石硖’龙眼低温转至常温下的果肉自溶相关。在‘储良’龙眼中,DI-XETl随着果肉的自溶而表达增强,说明DI-XETl基因表达特征与‘储良’龙眼果肉自溶密切相关;在低温贮藏期间,DI-XET2mRNA积累没有差别,转至常温贮藏后,自溶指数增大,其表达反而减弱;而DI-XET3呈组成型表达。 5、NAA和TDZ能诱导龙眼果皮快速生长时期DI-XET3mRNA的积累,而对DI-XETl和DI-XET2的表达没有影响;同时,NAA和TDZ处理不仅能够诱导DI-XETl和DI-XET2mRNA在快速生长时期的果肉中的积累,而且能够诱导该基因在成熟前期果实的果肉中的表达。 6、DI-XETl、DI-XET2和DI-XET3在一年生根和一年生茎中均有相应mRNA的积累,并且其积累量都比在幼根和幼茎多,推测三个基因可能参与了根和茎的生长;在叶片中,只有DI-XET3在一年生叶中的表达比幼叶中的表达强。
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