论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的多发于中老年的中枢神经系统退行性疾病。主要临床表现包括静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势步态障碍等。其主要病理改变为黑质(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡以及路易小体形成。目前,PD的确切病因仍未完全明了,包括遗传因素、环境因素和老化因素。氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍、凋亡、蛋白异常聚集、铁的过度沉积等均可能参与了PD的发病过程。α-突触核蛋白是PD特征性病理标志路易小体的主要成分,与家族性及散发性的PD有密切联系,其异常聚集被认为是PD发病的核心机制。α-突触核蛋白的翻译后修饰有多种形式,如磷酸化、泛素化、糖基化、硝基化等,其中蛋白质磷酸化是调节蛋白质功能最常见的,也是最重要的翻译后修饰方式。在生理条件下,大鼠体内约有4%的α-突触核蛋白处于第129位丝氨酸位点(Sl29)磷酸化状态,但在路易小体中有90%的α-突触核蛋白Sl29被磷酸化。α-突触核蛋白的磷酸化状态很明显可以影响其表达和聚集,磷酸化与α-突触核蛋白的清除机制相关。一些研究显示α-突触核蛋白Sl29磷酸化(p S129)促进包涵体形成,而另一些研究显示磷酸化作为代偿反应抑制包涵体形成或根本不起作用。因此,α-突触核蛋白的磷酸化对于其表达和聚集起到促进还是抑制作用,尚未明确。尸检表明,PD病人的黑质区铁含量明显上升,且黑质铁的水平与PD的进程相关,铁的过度沉积可能是PD发病中的关键因素。异常增加的铁水平促进活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生从而对DA能神经元造成损伤。前期研究证实铁可诱导α-突触核蛋白的表达及聚集,但该过程是否与α-突触核蛋白的磷酸化有关尚不明确。Polo样激酶2(polo-like kinase 2,PLK2)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,能特异性地磷酸化α-突触核蛋白S129。酪蛋白激酶2(casein kinase 2,CK2)是一种常见的含两个α或α’催化亚基与两个β调节亚基的丝氨酸/苏氨酸激酶。铁作用于α-突触核蛋白的磷酸化过程中是否有这两种激酶的参与也尚不明确。本研究在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞上,应用免疫印迹方法检测了枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)处理后,α-突触核蛋白表达水平及磷酸化水平,PLK2和CK2表达水平,以及自噬标志物LC3表达变化。用蛋白酶体活性检测试剂盒检测FAC对细胞内蛋白酶体活性的影响。用PLK2的抑制剂BI2536、CK2的抑制剂TBCA以及抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)预处理后,检测铁对上述指标影响的变化,以阐明铁在α-突触核蛋白磷酸化中的作用及机制。研究结果如下:1.1 mmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h,α-突触核蛋白表达水平于12 h开始增加,1 mmol/L FAC处理12 h~48 h后α-突触核蛋白表达水平分别增加81%、90%、93%、66%、51%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。结果提示,铁能够诱导α-突触核蛋白表达随时间变化逐渐上调,随后表达上调的程度有所减弱。2.1 mmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h,p S129表达水平于12 h开始增加,1 mmol/L FAC处理12 h~48 h后p S129表达水平分别增加115%、127%、152%、106%、68%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。α-突触核蛋白的磷酸化水平于16 h开始增加,1 mmol/L FAC处理16 h~48 h后p S129与α-突触核蛋白的比值分别增加42%、42%、47%、51%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。结果提示,铁能够诱导α-突触核蛋白的磷酸化水平随时间变化逐渐上调。3.1 mmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h,PLK2表达于12 h开始增加,1 mmol/L FAC处理12 h~48 h后PLK2表达水平分别增加33%、30%、53%、44%、35%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05);CK2表达于24 h开始增加,1 mmol/L FAC处理24 h与48 h后CK2表达水平分别增加46%与48%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。结果提示,铁能够诱导PLK2和CK2表达随时间变化逐渐上调,PLK2表达上调的程度随后有所减弱,CK2的上调明显晚于PLK2。4.20μmol/L TBCA、1μmol/L BI2536、20μmol/L TBCA与1μmol/L BI2536分别预处理SH-SY5Y细胞30min后与1 mmol/L FAC共孵育24 h,α-突触核蛋白表达水平分别降低43%、44%、41%,与FAC组相比,差别有统计学意义(P<0.01);α-突触核蛋白的磷酸化水平分别降低27%、31%、32%,与FAC组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。结果提示,CK2和PLK2的抑制剂可阻断高铁诱导的α-突触核蛋白的磷酸化水平及表达水平增加。5.20μmol/L TBCA处理SH-SY5Y细胞24 h后,PLK2表达水平增加41%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。1μmol/L BI2536处理SH-SY5Y细胞24 h后,与对照组相比,CK2表达水平没有明显变化。结果提示,细胞内CK2的活性变化会影响PLK2的表达,作用于同一靶点的不同激酶之间存在相互影响。6.0.5 mmol/L NAC预处理SH-SY5Y细胞30 min后与1 mmol/L FAC共孵育24 h,PLK2与CK2的蛋白表达水平以及α-突触核蛋白的磷酸化水平回到正常,与FAC组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。然而NAC和FAC共孵育24 h后α-突触核蛋白表达水平仍比对照组高出32%,差别有统计学意义(P<0.05)。结果提示,抗氧化剂NAC能够完全阻断高铁诱导的PLK2和CK2表达水平以及α-突触核蛋白磷酸化水平上调,仅部分阻断高铁诱导的α-突触核蛋白表达上调。7.1 mmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞24 h后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和蛋白酶体活性分别增加147%和12%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。0.5 mmol/L NAC预处理SH-SY5Y细胞30 min后与1 mmol/L FAC共孵育24 h,LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值下调22%,与FAC组相比,差别有统计学意义(P<0.05);蛋白酶体活性与FAC组相比下调5%。结果提示,铁能够诱导细胞内自噬水平和蛋白酶体活性增加,抗氧化剂NAC能够部分阻断铁诱导的该上调作用,与α-突触核蛋白的表达变化相一致。上述实验结果表明,铁负载可上调α-突触核蛋白的表达,抗氧化剂NAC处理可部分阻断该上调作用,提示氧化应激参与了铁诱导的α-突触核蛋白表达上调。高铁可上调SH-SY5Y细胞内磷酸激酶PLK2和CK2的蛋白表达水平,从而上调α-突触核蛋白的磷酸化水平。CK2和PLK2的抑制剂可阻断高铁诱导的α-突触核蛋白表达水平和磷酸化水平增加。其中PLK2在铁诱导磷酸化过程中的作用更明显。高铁诱导的PLK2和CK2表达水平和α-突触核蛋白磷酸化水平上调可被NAC阻断,说明氧化应激在铁对α-突触核蛋白磷酸化的影响过程中起到关键作用。高铁处理后细胞内自噬水平和泛素蛋白酶体活性增加,NAC预处理可部分阻断该上调作用,与α-突触核蛋白的表达变化相一致,表明这两个系统的激活可能是作为细胞增强对α-突触核蛋白的清除而发挥作用。本实验所研究的铁对α-突触核蛋白磷酸化的作用影响以及对其可能机制的初步探讨,为进一步深入探讨PD发病过程中铁与α-突触核蛋白相互作用的机制及干预措施,提供了新的实验依据。