【摘 要】
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雌性激素包括雌激素与孕激素两大类,对女性发育和生殖功能至关重要。雌激素主要有雌酮、雌二醇和雌三醇,孕激素以孕酮为主。雌激素、孕激素水平是生殖监测中不可或缺的临床指
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雌性激素包括雌激素与孕激素两大类,对女性发育和生殖功能至关重要。雌激素主要有雌酮、雌二醇和雌三醇,孕激素以孕酮为主。雌激素、孕激素水平是生殖监测中不可或缺的临床指标,性激素六项中就包含雌二醇和孕酮,对不孕症的病因诊断、疗效观察、预后判断及生殖生理作用机制的研究具有重要意义。国内外性激素常规检查方法以血清为样本,连续采血检测易引起病人心理压力,且存在安全风险,开发快速无创监测性激素水平方法有较大需求。近期研究发现,雌酮和孕酮的尿液代谢物,雌酮-3-葡糖苷酸(Estrone-3-glucuronide,E1G)和孕二醇-3-葡糖苷酸(Pregnanediol-3-glucuronide,PdG)浓度与血清雌酮孕酮浓度呈线性相关,使得通过尿液无创监控雌酮孕酮水平成为可能。但是E1G和PdG分子量低、免疫原性弱,是哺乳动物体内本身存在的代谢物,难以通过传统免疫方法稳定获得抗体,或高特异性和高亲和力抗体,成为此类检测产品开发的限制因素。随着基因工程和重组抗体技术的发展,第三代抗体尤其是抗原结合片段(Fragment antigen-binding,Fab),在制备小分子抗原抗体中展现出巨大潜力。结合体外展示技术,能高通量快速筛选出高亲和力高特异性抗体,且制备工艺简单、周期短,可应用于预防、诊断、治疗、检测等领域。本研究利用噬菌体展示技术分别构建了E1G和PdG的Fab抗体库,并通过3-4轮淘筛及酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)验证获得了E1G和PdG的Fab抗体,并对获得的抗体进行了序列分析。本研究主要结果如下:1.以半抗原E1G-BSA和PdG-BSA免疫小鼠,通过效价测定动态监测了小鼠体内相应抗体产生的趋势,结果表明两种半抗原免疫小鼠后均能产生高效价抗体。两种半抗原抗体效价在第9周达到峰值,E1G-BSA效价最高达到1:32000-1:64000,PdG-BSA效价达到1:16000-1:32000,且在小鼠体内抗体产生可维持约6周。2.选取免疫第9周的小鼠取脾脏,抽提脾细胞总RNA后通过反转录获得cDNA,再以cDNA为模板,经过三轮重叠延伸PCR得到Fab片段。通过酶切和连接构建了pComb3Xλ-Fab重组噬菌粒载体,电转化XL1-Blue菌得到两个库容分别为1.13×10~7和1.03×10~6的Fab噬菌体抗体库,其重组率分别约为78.57%和92.31%,背景连接率均为0%。3.对构建好的噬菌体抗体库分别进行3-4轮淘选,从富集到的阳性克隆中随机选择克隆进行可溶性抗体片段ELISA分析,获得了多个与E1G或PdG具有高亲和力的抗体。又从中选择了亲和力较好的共9个克隆进行Sanger测序和IMGT/V-QUEST比对,表明针对E1G或PdG的抗体具有类似的结构特征。随后选取两个亲和力较好的克隆E1G-F6和E1G-F8,对于E1G差别极小的三种小分子化合物进行了交叉反应测试,结果证实Fab抗体确实能够识别分子差异极小的小分子化合物。
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