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背景胰腺导管腺癌（简称胰腺癌）是预后极差的一类恶性肿瘤,发病率几乎等同于死亡率[1]。我国胰腺癌病人的中位生存时间为35个月,1年生存率小于10%,5年生存率低至6%[2-3]。大多数胰腺癌患者无明显症状,一经发现即为晚期,只有20%的患者可以进行手术切除,瘤体完全切除的患者的5年生存率也仅达到25%[1-2]。胰腺癌本身的生物学特性以及对放化疗的抗性均是其复发转移的有利因素[4]。有大量研究证实钙离子通道及钙离子瞬变在肿瘤生长中起到非常重要的作用[5-8]。基质相互作用蛋白分子1（stromal interaction molecule 1,STIM1）是一种钙离子传感器,定位于内质网膜上,是调控钙离子通道的关键分子,参与多种肿瘤细胞的生长、凋亡、侵袭转移等生物学行为[9-14],包括肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾上腺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、睾丸癌及胰腺癌等[15-16]。而缺氧也是癌变的基本特征,有研究证实在肝癌中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达升高,并且直接调控STIM1介导的钙离子流动,促进肝癌形成[17]。在本研究前期工作中我们发现,STIM1在胰腺癌细胞中表达明显高于正常胰腺细胞,并且与HIF-1α的表达趋势一致,但在胰腺癌中HIF-1α和STIM1的作用机制尚未完全清楚。因此,本研究旨在:探讨HIF-1α与STIM1的相关性,并明确其调控机制;在临床病历水平,细胞水平研究STIM1对胰腺癌的调控机制。方法1.对胰腺导管腺癌手术组织标本进行HIF-1α和STIM1的免疫组化染色实验,分析胰腺导管腺癌中STIM1和HIF-1α表达水平及其相关性;并对患者进行随访,统计STIM1表达水平与预后生存关系。2.应用Westernblot的方法检测正常胰腺导管上皮细胞及多种胰腺癌细胞系中HIF-1α和STIM1的基础表达水平;并在此基础上应用分子克隆方法构STIM1降表达质粒,建立稳定转染细胞系;用Westernblot检测所构建稳系STIM1的表达水平。3.利用上述构建的细胞系进行Transwell实验及EMT相关蛋白表达的Westernblot实验验证,观察STIM1表达水平对胰腺癌细胞迁移侵袭能力的影响4.通过RT-PCR实验验证在mRNA水平上HIF-1α表达水平对STIM1表达量的影响。5.利用CHIP和双荧光素酶实验验证HIF-1α与STIM1之间的调控关系。结果1.STIM1在胰腺癌组织中的表达及与HIF-1α表达的相关性。对所收集的组织进行STIM1及HIF-1α的免疫组织化学染色:STIM1在胰腺正常导管组织中呈现低表达,而在胰腺导管腺癌组织中呈现高表达。HIF-1α与STIM1表达呈正相关,肿瘤组织分化越差,HIF-1α和STIM1表达水平越高,且预后生存越差,具有统计学意义。2.Westernblot实验验证蛋白水平HIF-1α和STIM1表达关系。选取4对胰腺癌和癌旁的正常组织标本,可以看出HIF-1α和STIM1在胰腺癌细胞中同时出现表达上调。选取L3.7-2、SW1990、Miapaca2、PANC-1、CFPAC-1、BxPC-3和AsPC-1七种细胞系,Westernblot验证HIF-1α和STIM1的基础表达,在L3.7-2、SW1990、Miapaca2、PANC-1、CFPAC-1四种细胞系表现为同时上调。选择PANC-1、CFPAC-1、SW19903种高表达细胞系,作STIM1敲除稳系,并验证其表达情况。可得出HIF-1α和STIM1在蛋白水平的表达也呈现正相关。3.体外细胞功能学实验证明STIM1的过表达可以增强胰腺癌细胞的侵袭和转移。选择SW1990和SW1990 KO STIM1细胞系进行Transwell实验,发现SW1990 KO STIM1细胞系侵袭迁移能力明显减弱。且对敲除STIM1的PANC-1细胞系进行Westernblot验证,可发现E-cadherin的表达下调,Vimentin的表达上调,表明STIM1参与EMT的进展。综上可得出上调STIM1的表达可以增强胰腺癌细胞系的侵袭和转移能力,反之,STIM1下调对胰腺癌细胞系的侵袭和迁移能力有明显抑制作用,且具有统计学意义。4.在mRNA水平验证HIF-1α与STIM1的表达相关性。通过免疫组化及Westernblot证实HIF-1α与STIM1表达存在正相关关系。我们进一步通过qPCR实验证实,当HIF-1α基因敲低后,STIM1表达水平显著下降,具有统计学意义。5.染色质免疫共沉淀（ChIP）实验结合双荧光素酶实验验证HIF-1α对STIM1的调控作用。相关生物学分析提示在STIM1的启动子区存在HIF-1α转录结合的靶向序列,我们进一步通过ChIP实验验证STIM1启动子区存在两个HIF-1α的结合部位。将HIF-1α和含有STIM1启动子的质粒共转染到PANC-1细胞中进行双荧光素酶测定,证实STIM1是HIF-1α的直接靶基因;而将shHIF-1α转染PANC-1细胞后,HIF-1α和STIM1在mRNA及蛋白质水平表达均出现显著抑制。证实了在胰腺癌细胞中,STIM1受HIF-1α的直接调控。结论1.STIM1的表达水平与胰腺癌患者预后显著相关。2.STIM1可以促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移。3.HIF-1α可以结合到STIM1启动子区,并调控STIM1的表达。