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研究背景与目的横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是起源于骨骼肌的恶性肿瘤,也是儿童期最常见的软组织肿瘤,肌祖细胞增殖和分化失衡是其发生的主要原因,但相关分子机制,目前知之甚少,因此,阐明肌祖细胞增殖和分化的调控机制,对于揭示横纹肌肉瘤的发病机制具有重要意义。GATA家族是具有锌指结构的转录因子,能够结合靶基因启动子区域的WGATAA序列,从而调控基因的表达,其家族成员GATA4在调节成肌细胞C2C12的增殖和分化中起着重要作用,但在横纹肌肉瘤发生中的机制,目前尚未阐明。Polycomb复合体是一组抑制基因转录的蛋白,其复合体成员EZH2可通过对GATA4蛋白第299位赖氨酸甲基化从而抑制GATA4的转录活性。但二者在横纹肌肉瘤发生中的机制,目前尚未阐明。研究表明,micro RNA调节异常也与横纹肌肉瘤存在密切关系。micro RNA异常如肌肉特异性micro RNA(miR-1、miR-133a/b、miR-206)和miR-29家族异常,都会诱发横纹肌肉瘤的发生,但其精确机制,还有待于进一步阐明。本研究发现GATA4与EZH2通过调控miR-29a的表达,从而调控成肌细胞C2C12的增殖和分化,并在横纹肌肉瘤的发生中发挥作用。因此本课题旨在揭示C2C12的增殖和分化及横纹肌肉瘤发生的分子机制,以期为其治疗和预后评估提供理论依据。研究方法1.生物信息学软件预测,cyclin D2是miR-29a的下游靶基因,本研究中我们采用瞬时转染、MTT法、流式细胞分析、DAPI染色、荧光素酶报告基因、QPCR及Westem Blot实验来研究miR-29a靶向cyclin D2,对细胞增殖、周期和凋亡的影响。2.本研究中,我们采用稳定转染、QPCR、Westem Blotting、CO-IP和CHIP等实验方法,研究GATA4调控miR-29a的分子机制。实验结果1.MTT、流式细胞分析及DAPI染色结果表明,miR-29a引起细胞增殖抑制、周期阻滞和诱导凋亡。2.Luciferase结果显示,miR-29a能够与预测的cyclin D2 3’-UTR区域发生特异性结合,从而降低荧光素酶活性。3.Western Blotting和QPCR进一步证实了miR-29a可以在蛋白和m RNA水平下调cyclin D2的表达,表明miR-29a通过转录后沉默机制抑制了cyclin D2的表达,明确了cyclin D2确为miR-29a的靶基因。4.CHIP实验可知,GATA4招募PCG蛋白EZH2(PRC2),BMI1和RING1B(PRC1),H3K27me3富集于miR-29a的启动子区域,使其处于抑制状态。5.CO-IP实验进一步揭示GATA4与EZH2存在细胞内相互作用,这些结果初步阐明GATA4抑制miR-29a转录活性的内在分子机制。6.Western Blotting和QPCR证实,GATA4能够在m RNA水平抑制miR-29a,在蛋白和m RNA水平促进cyclin D2的表达。7.C2C12分化过程中的CHIP实验可知,GATA4与PCG蛋白不结合到miR-29a的启动子区域。结论1.miR-29a通过下调其下游靶基因cyclin D2的表达,抑制C2C12细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。2.在C2C12细胞中,GATA4通过招募Polycomb家族蛋白抑制miR-29a表达,上调cyclin D2表达,从而促进细胞增殖。3.在C2C12细胞分化过程中,GATA4与PCG蛋白不结合到miR-29a的启动子区域,对miR-29a表达的抑制作用消除,促进分化。