目的本实验通过RT-PCR法构建重组质粒pJC,并通过间接免疫荧光法探究重组质粒pJC在CHO细胞株中能否进行表达及其分布,为研究日本脑炎病毒结构蛋白间相互作用及病毒毒力等研究奠定基础。材料与方法一、实验材料1、细胞、质粒及菌株中华仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞购自中国科学研究院上海细胞库,生长于37℃,5%CO₂及含10%胎牛血清（Fatal calf serum,FCS）的Dulbecco’modified eagle medium（D-MEM）高糖培养液中;BALB/c鼠购自中国科学院上海实验动物中心;含FLAG片段的JEV C蛋白编码基因重组质粒被命名为pJC,由本实验室构建;真核表达载体pcDNA3.1（+）购自Invitrogen公司,用于JEV C蛋白编码基因重组子的构建;大肠杆菌JM109与DH5α购自Takara公司,用于重组质粒构建、转化。2、试剂及抗体RNA抽提试剂（Code No.D312）,RT-PCR试剂盒（Code No.DR027A）,DNA片断纯化试剂盒（Takara,product No.DV807）,DNA A尾试剂盒（Takara,product No.D404）,琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（Takara,product No.DV805）,DNA连接试剂盒（Takara,product No.D6023）,质粒小剂量提取试剂盒（Takara,product No.DV801A）,限制性内切酶EcoRI、BamHI均购自Takara公司,用于重组质粒的构建和酶切鉴定。脂质体（Lipofectamine2000）购自Invitrogen公司,用于CHO细胞转染。氨苄青霉素购自Sigma公司,琼脂糖购自Takara公司,用于质粒的转化和电泳分析;D-MEM高糖培养液,10%FCS,青霉素购自海科隆公司,用于CHO细胞的培养;荧光二抗购自cell signaling公司,FITC标记的山羊抗兔IgG（H+L）购自北京中杉金桥公司,用于质粒转染后的免疫荧光检测。二、实验方法1、JEV C蛋白编码基因重组质粒构建以日本脑炎病毒SA14-14-2株Total RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增日本脑炎病毒核心蛋白C基因,并在基因两侧加入起始密码子与终止密码子,然后在基因两侧加入BamHI/EcoRI酶切位点。反转录引物:5’GAATTCTTAGGCTC-CTGCACAAGCTATGAC3’,限制性内切酶EcoRI（-GAA TTC-）合成至日本脑炎病毒核心蛋白C编码基因5’末端。PCR法扩增前向引物5’GGATCCATGACTAA-AAAACCAGGAGGGC3’,BamHI（-GGA TCC-）合成于5’末端,反向引物为上述反转录引物。1%琼脂糖凝胶电泳并回收最终PCR产物,后者与pMD19-T simple连接构建重组子pMD-JC。使用PrimeSTAR（?）HS DNA Polymerase（CodeNo.DR0--10S）,对重组质粒pMD-JC以CTB905 F（5’CGGGATCCATGGACTACAAGG-ACGACGATGACAAGATGACTAAAAAACCAGGAGGG3’）为引物进行PCR扩增。将PCR扩增产物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（CodeNo.DV805A）进行切胶回收约500bp的片段后,使用BamHI/EcoRI进行酶切,经乙醇沉淀后,命名为Insert DNA;将质粒pcDNA3.1（+）使用BamHI/EcoRI进行酶切,然后使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（Code-No.DV805A）切胶回收约5.4kbp的DNA片段后,命名为Vector DNA;使用TaKaRaDNA Ligation Kit（Code No.D6022）中的Solution I将Insert DNA和VectorDNA连接后,热转化至E.coli Competent Cell JM109（Code No.D9052）中,涂布平板,37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌,提取质粒命名为pJC,使用引物BGHrev对上述质粒进行测序,结果正确。转化pJC于大肠杆菌DH5α,小剂量提取质粒并经BamHI/EcoRI酶切电泳鉴定。2、JEv C蛋白编码基因重组质粒转染CHO细胞采用脂质体转染法将pJC转染CHO细胞,同时设空载体pcDNA3.1（+）转染细胞与未转染细胞为阴性对照。具体方法为:1.转染实验前天以4×10⁵细胞/mL接种CHO细胞于6孔板中（每孔1mL）,37℃,5%CO₂条件下常规培养24h至转染当天细胞达到90%以上汇合。2.转染:胰酶消化转染用的CHO细胞,将其接种于6孔板中的盖玻片,以盖满玻片不溢出为度,于37℃,5%CO₂的条件下常规培养24h至转染当天细胞达到90%以上汇合;配制脂质体/质粒混合物:溶液A:将重组质粒pJC和空载体pcDNA3.1（+）各4μg（每孔）加入D-MEM培养液中,溶液总体积各为250μl（每孔）,轻轻混匀;溶液B:将10μl脂质体加入240μlDMEM培养液中,共四管,轻轻混匀,室温孵育5min;将稀释的重组质粒pJC和空载体pcDNA3.1（+）分别与250μl脂质体稀释液轻轻混匀,室温孵育20min（这时溶液会变浑浊）以形成脂质体/质粒混合物;用无血清无抗生素的D-MEM培养液洗细胞3次,转染前的短时间内更换1ml37℃预温好的无血清无抗生素的D-MEM培养液;向6孔板中逐滴加入500μl脂质体/质粒混合物,边加边摇动培养板;在37℃,5%的CO2中培养5～6小时后用无血清无抗生素的D-MEM培养液洗涤细胞3次,更换含有10%FCS的D-MEM培养液,常规培养72h;以备下一步做免疫荧光用。3、免疫荧光检测6孔组织培养板培养pJC转染的CHO细胞,待细胞密度达到60%-70%时,4%多聚甲醛固定细胞1h,0.1%Triton-100打孔10min,10%BSA封闭1h,FITC标记的山羊抗兔IgG（H+L）4℃过夜孵育,荧光二抗37℃避光孵育1h,50%甘油封片后于荧光显微镜下观察。实验结果1、JEV C蛋白编码基因重组质粒的构建以日本脑炎病毒SA14-14-2株Total RNA为模板,经RT-PCR法获得含有FLAG片段的JEV C蛋白编码基因重组子pJC,测序分析与发表的基因序列相符合。经酶切鉴定表明:重组质粒经BamHI/EcoRI酶切释出的插入子相对分子量为500bps与pJC经相同酶切释出插入子的分子量大小相一致,应用pcDNA3.1 T7噬菌体启动子引物测序分析目的基因在真核表达载体中正常连接。2、JEV C蛋白编码基因重组质粒转染的CHO细胞的免疫荧光检测JEV C蛋白编码基因重组质粒转染的CHO细胞可见较显著绿色荧光标记,主要分布在胞浆,少量分布于胞膜。空载体转染或未进行转染的CHO细胞中未见特异性绿色荧光标记,仅见散在的非特异性绿色荧光杂质。结论1、构建的重组子pJC含有JEV C蛋白编码基因。2、转染了JEV C蛋白编码基因重组质粒的CHO细胞能够表达JEV C蛋白,主要分布在胞浆,少量分布于胞膜。