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研究背景二硫化碳(Carbon disulfide, CS2)是工业上常用的有机溶剂,也是生产人造纤维、玻璃纸等许多化学物质的原材料。此外,在橡胶硫化、谷物熏蒸、浮选、石油精制、石蜡溶解以及油脂提取等工业生产过程中都有可能接触CS2。由于我国是服装生产大国,该行业属于劳动密集型行业,从业人数众多,特别在人造丝、人造毛等纺织企业中,女工占相当大的比例。CS2具有多系统毒性,可引起中枢神经系统和周围神经系统的慢性损伤,对视觉系统、听觉系统、前庭功能、心血管系统和生殖系统都有一定的影响。在对生殖毒性的研究中发现,CS2可导致男工性功能障碍,睾丸萎缩,精子数目减少、活动力下降和畸形精子增多;接触CS2女工多见月经周期异常、痛经、经期延长、血量增多,更严重的可引起怀孕女工自然流产、死胎死产等现象。本课题组对欲生育的CS2作业女工进行前瞻性研究发现,CS2作业女工受孕时间延长,使该作业女工获得一次临床可识别妊娠的概率明显降低;另外发现早早孕丢失率增加,近半数受精卵不能正常着床而丢失。说明CS2对胚胎早期发育有损伤作用。为了进一步验证CS2的胚胎毒性并探讨其毒作用机制,本课题组建立了小鼠动物模型。动物实验发现,卵泡发育期和胚胎植入期暴露CS2,均可导致小鼠胚胎发育障碍和胚胎植入数目减少,并发现胚胎植入期是CS2致胚胎发育毒性的一个敏感毒作用位点,但是目前关于胚胎植入障碍机制尚不清楚。已知良好的子宫内膜容受性是胚胎顺利植入的前提条件,但关于子宫内膜容受性的问题研究报道甚少,尚缺少用于筛选和评价早期生殖损伤效应的敏感观察指标。以上问题对职业性CS2暴露女工劳动保护措施的修订和实施至关重要。研究目的建立植入期CS2暴露致胚胎毒性动物模型,检测植入期CS2暴露对子宫内膜细胞DNA损伤和细胞凋亡的影响作用,分析小鼠胚胎毒性、子宫内膜细胞DNA损伤和细胞凋亡程度与CS2暴露强度之间关系,以揭示植入期CS2暴露致胚胎毒作用机理,为CS2暴露女工职业劳动保护措施的修订和实施提供理论依据。研究方法1.实验设计1.1胚胎植入期小鼠CS2暴露,孕9天(GD 9)观察胚胎毒性;1.2获取胚胎植入期小鼠子宫内膜,制备单细胞以建立利用小鼠子宫内膜细胞检测DNA损伤的研究方法,利用体外实验验证其检测CS2致DNA损伤的敏感性;1.3胚胎植入期小鼠CS2暴露(体内实验),GD 5获取子宫内膜,制备单细胞悬液,用SCGE技术检测DNA损伤;1.4胚胎植入期小鼠CS2暴露,制备GD 5子宫内膜细胞,用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色法测定细胞凋亡;1.5胚胎植入期小鼠暴露CS2,制备GD 5子宫组织石蜡切片,用TUNEL方法测定细胞凋亡。2.实验动物及分组:清洁级8-12w性成熟昆明种(KM)小鼠,雌性体重为27-30g;雄性小鼠30-35g,单笼饲养。雌鼠与雄鼠1:1合笼受孕。查到阴栓日即为孕1天(GD 1),按体重随机分组。3.促排卵处理:腹腔注射10U PMSG,48h后腹腔注射10U HCG。4.染毒处理:染毒时间:GD4.5,单次暴露;染毒剂量:0.1 LD50(即631.4mg/kg)为低剂量,0.2 LD50为中剂量,0.4 LD50为高剂量;溶剂为橄榄油;染毒方式:腹腔注射;染毒容积:0.1ml/10g体重。5.实验方法:5.1单细胞凝胶电泳技术:参考Singh方法稍作改进,建立适用于检测子宫内膜细胞的实验方法。荧光显微镜采集图像,CASP系统自动分析各项指标,SPSS16.0统计软件分析数据。5.2流式细胞术检测胚胎植入期子宫内膜细胞凋亡:制备子宫内膜细胞悬液,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色法测定细胞凋亡程度。5.3脱氧核苷酸末端转移介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡:制备石蜡切片后,根据罗氏公司TUNEL试剂盒说明检测细胞凋亡程度。6.统计分析方法采用SPSS 16.0建立数据库,测量结果均以x±s表示;方差齐性时采用F检验;方差不齐时采用Brown-Forsythe统计量检验;采用最小显著差(LSD)t检验方法进行样本间两两比较。统计学检验水准设定为a=0.05。研究结果1.胚胎植入期暴露CS2致小鼠胚胎毒性研究结果胚胎毒性:高、中、低剂量暴露组小鼠胚胎植入数目明显降低,分别比对照组减少了32.3%、65.1%和67.4%(P<0.05);宫胚重明显降低,分别比对照组减少了40.3%、57.9%和71.9%(P<0.05);胚胎总重均明显降低,分别比对照组减少了54.7%、68.2%和85.4%(P<0.05);校正胚胎植入数后,各组的胚胎均重与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。母体毒性:胚胎植入孕鼠的体重增加值和肝脏重量变化均不明显(P>0.05),母体毒性较小。2.胚胎植入期暴露CS2致小鼠子宫内膜细胞DNA损伤的研究结果体外实验结果:建立单细胞凝胶电泳技术检测子宫内膜细胞DNA损伤的实验方法,在荧光显微镜下可见正常细胞和较为典型彗星细胞图像。不同暴露剂量的Head DNA%、Tail DNA%、TL、CL、TM、OTM与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.001)。Head DNA%、Tail DNA%、TL、TM、OTM与暴露剂量之间回归系数分别为-13.78、13.78、0.05、4.38、3.23(P<0.01)。体内实验结果:低、中、高剂量暴露组的DNA损伤指标Head DNA%、TailDNA%、TL、CL、TM与对照组相比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。中剂量、高剂量暴露组的OTM比对照组增加了5.88和9.21倍(P<0.01)。Head DNA%、Tail DNA%、TL、TM、OTM与暴露剂量的回归系数分别为-0.021、0.021、0.014、0.043、0.062,差异有统计学意义(P<0.01)。3.胚胎植入期暴露CS2致小鼠子宫内膜细胞凋亡的研究结果植入期小鼠子宫内膜细胞凋亡结果:Annexin V-FITC/PI染色法检测小鼠子宫内膜细胞凋亡率发现,中剂量和高剂量暴露组与对照组相比,凋亡率分别增高89.26%、274.50%,差异有统计学意义(P<0.05)。TUNEL方法检测小鼠子宫内膜细胞凋亡率的变化情况发现,中剂量和高剂量暴露组的凋亡率与对照组相比,凋亡率分别增高89.9%、121.8%,差异有统计学意义(P<0.05),此结果和Annexin V-FITC/PI染色法检测的结果相一致。结论1.胚胎植入期CS2暴露可导致明显的胚胎毒性,表现为各暴露剂量小鼠胚胎植入数目明显减少,存在胚胎丢失现象。2.胚胎植入期CS2暴露可造成子宫内膜细胞DNA损伤和子宫内膜细胞凋亡,子宫内膜细胞损伤程度增加呈现出明确的剂量反应关系。提示胚胎植入期CS2暴露可能通过损伤子宫内膜细胞影响其容受性,导致胚胎植入障碍。