α-地中海贫血、β-地中海贫血和DMD都是严重危害人类生命健康的最常见单基因遗传病,目前,临床上只能对常见的点突变和缺失重复突变进行检测,而由于点突变致病的患儿或携带者往往会漏诊或得不到基因诊断。如DMD基因,由于其基因序列庞大并且没有点突变热区,在临床上只能对缺失和重复突变进行检测,而点突变致病的病人失去基因诊断的机会,也意味着他们家族不能进行DMD的产前诊断;β-地中海贫血突变如果不是常见的突变,可能导致中重度患儿的出生。测序是点突变检测的金标准但是繁琐并且成本高、工作量大。因此急需寻求一种简单、灵敏度高的点突变检测方法,很多研究致力于通过先对该基因进行点突变筛查,筛查出怀疑点突变的序列后再进行测序,从而大大减轻成本以及工作量。最近不少文献认为HRM分析方法是一种很好的新点突变检测方法。第一部分建立HRM分析检测单基因遗传病点突变目的以β-珠蛋白、DMD和α-珠蛋白的基因为研究对象,建立应用HRM分析方法检测单基因遗传病点突变的方法,并探讨该方法是否适用于基因纯合突变的检测。方法1.采用LightScanner96和LightScanner32 HRM分析仪进行检测,结合琼脂糖凝胶电泳对引物、引物浓度、引物最佳退火温度、镁离子浓度、模板起始量及染料加入的时间进行摸索。2.对76个包含正常及点突变的β-珠蛋白的标本进行检测,其中有12个是常见突变基因型的纯合突变标本,对这些纯合的突变标本进行两种方法检测,首先进行常规的点突变筛查扫描然后加入等比例的野生型标本混合后再进行扫描检测。并且将该方法对8个DMD,其中一个为DMD第四外显子已知点突变进行检测。3.用突变筛查扫描法及不对称PCR结合非标记封闭探针法对24个含正常和α-地贫的CS、QS、WS三种点突变标本检测。4.对怀疑存在点突变的标本用ABI 3100基因测序仪对β-珠蛋白基因进行测序。结果用HRM方法检测基因点突变时,需要把模板起始浓度稀释为同一浓度;引物最佳退火温度比加入染料前的温度要高。该方法可对β-珠蛋白点突变进行扫描筛查,结果与RDB方法或测序方法一致;对于一个DMD男性患者第四外显子点突变的标本和十二个CD41/42、IVS-ΙΙ-654、TATAbos -28、CD17的纯合突变标本均可以通过直接扫描及野生型标本混合后进行扫描两种方法进行区分。而不对称PCR结合非标记封闭探针法对α-地贫的CS、QS、WS三种点突变标本检测未能成功,需进一步优化。结论本研究建立了应用HRM分析方法对单基因点突变遗传病检测的平台,可快速、可靠地对杂合和纯合点突变的基因进行检测。第二部分β-地中海贫血的临床检测第一章HbA2筛查β-地中海贫血的作用目的评估HbA2升高(≥3.5%)筛查β?地中海贫血的作用。方法应用血常规自动分析仪对360名妇女进行血常规检测,高效液相色谱法血红蛋白电泳进行HbA2水平检测。第一组为HbA2水平≥3.5%的65名孕妇,85名为非孕妇女,均进行RDB或β-珠蛋白基因测序检测,第二组为HbA2水平< 3.5%的96名孕妇,114名非孕妇女,如果MCH>29pg, MCV>90fl的不作基因检测,HbA2值在3.0%-3.5%进行β-珠蛋白基因测序,其余的进行RDB方法检测。利用t检验对HbA2的值进行统计。结果1.第一组中(n= 150名,20-40岁),其中65名为孕妇,85名为非孕妇女,她们的HbA2水平≥3.5%,RDB方法检测显示147名为中国常见的β-地中海贫血突变,其中三名用RDB检测未见异常,经测序分析发现其中两例为RDB不能检测的Hb Kaohsiung杂合点突变即HBB:c.341T > A杂合点突变,第三例为-90 (C>T)杂合点突变即HBB:c.-140C>T杂合点突变。2.第二组中(n= 210, 20-40岁),其中96名孕妇,114名非孕妇女,RDB方法检测显示均未发现β-地中海贫血基因突变,并且用测序方法检测HbA2范围在3.0%-3.5%的标本,也未发现存在β-地中海贫血基因突变。3.没有地中海贫血携带的孕妇跟非孕妇比较,孕妇的HbA2水平轻微升高(P<0.05),但她们HbA2的水平均未超过或者达到3.5%。结论妊娠虽然可使HbA2的水平稍微升高,但是并未影响到HbA2对β-地中海贫血携带者的筛查作用,不论在孕妇还是非孕妇中,HbA2均有很好的筛查β-地中海贫血携带者的价值。第二章应用HRM分析检测β?地中海贫血基因点突变目的应用上述建立的HRM分析方法对未知基因型的标本进行β-珠蛋白基因检测,探讨其临床应用的可行性。方法1.应用上述第一部分优化的条件方法对未知基因型的标本进行检测。2.选取60个标本,其中包含5个血液学和HbA2确认的β?地中海贫血携带但是RDB方法没发现异常的标本,先进行HRM分析检测再进行RDB或β-珠蛋白序列测序检测进行结果比较。3.进行HRM分析检测时加入中国最常见的β?地中海贫血杂合突变基因型标本作阳性对照及正常野生型标本作为阴性对照。结果P1+P2引物的反应产物中,有一个标本通过与RDB和测序检测结果相比较发现为假阳性。其它检测出存在突变的标本的曲线均与阳性对照分型一致。5个外送的血液学提示β?地中海贫血携带的标本中均在扫描时发现有异常曲线,经测序检测确认为一个Hb G-Coushatta即HBB:c.68A>C、一个Cd37 (TGG>TAG)即HBB:c.113G>A、一个Hb L’Aquila即HBB:c.319C>G和两个Hb New York即HBB:c.341T>A杂合突变,其余结果与RDB方法或测序方法确定的基因型一致。结论HRM分析方法可对临床β?地中海贫血突变进行快速的分型和突变扫描检测。