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目的1检测胃癌组织及癌旁正常胃粘膜组织中胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)、胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)和二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase,DPD)的表达,并检测胃癌患者外周血中DPD的活性,分析TS、TP及DPD三种指标与胃癌患者临床病理特征、化疗疗效、毒副反应及预后的关系,评估它们作为5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性和毒性判定指标的可行性,为临床制定个体化、合理化的化疗方案提供参考依据,并探讨其能否作为判断胃癌预后的分子生物学指标。2分析胃癌组织中TS、TP及DPD的表达与肿瘤血管生成的关系。3比较免疫组织化学法与蛋白免疫印迹法对胃癌组织中TS、TP及DPD表达水平测定的结果。方法1采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法检测107例胃癌组织标本,其中77例行胃癌根治术,30例经病理证实为晚期胃癌;25例癌旁(距癌灶边缘>5cm)正常胃粘膜组织中TS、TP及DPD的表达,免疫组织化学法CD34标记胃癌组织中微血管密度。2采用蛋白免疫印迹(western blot)方法检测胃癌根治术、病理证实、术前未行放化疗等抗肿瘤治疗、术后行5-FU为主方案化疗的40例胃癌病例及20例癌旁(距癌灶边缘>5cm)正常胃粘膜组织中TS、TP及DPD的表达。3采用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)技术检测肿瘤内科住院治疗的胃癌患者66例,所有患者均为胃癌根治术后首次接受化疗,化疗方案为FOLFOX4方案,化疗前采用HPLC技术检测患者外周血中二氢尿嘧啶(dihydrouracil, UH2)和尿嘧啶(uracil,U),并计算两者比值间接反映DPD活性。结果1免疫组织化学实验部分:(1) 77例胃癌组织中TS、TP及DPD阳性表达率分别为70.13%,59.74%,85.71%,25例癌旁正常胃粘膜组织中TS、TP及DPD阳性表达率分别为24.0%,12.0%,48.0%,TS、TP及DPD在胃癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常胃粘膜组织中的阳性表达率,差异有统计学意义( x 2分别为16.580,17.232,14.919, p <0.01)。(2)TS的表达与胃癌淋巴结转移存在正相关关系( r =0.743, p <0.05),与其它临床病理特征间差异均无统计学意义( p >0.05);TP的表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移及胃癌分期间差异均有统计学意义( x 2分别为6.196,16.235,9.701,37.774,p <0.05),相关分析显示TP的表达与浸润深度、淋巴结转移、胃癌分期存在正相关关系( r分别为0.426,0.355,0.619, p <0.01);DPD的表达与胃癌临床病理特征间差异均无统计学意义( p >0.05)。(3) Logistic回归分析显示, TP表达与胃癌分期相关( p =0.027),回归方程检验分类能力83.1%, x 2为43.703,p =0.000。( 4)30例可评价化疗疗效的病例中,TS阴性表达者与阳性表达者的化疗有效率分别为77.78%和28.57%,两者比较差异有统计学意义( x 2=4.370,p <0.05) ; TP阴性表达者化疗有效率为25.00%,阳性表达者化疗有效率为66.67%,两者比较差异有统计学意义( x 2=5.000, p <0.05);DPD阳性表达者化疗有效率为21.43%,而阴性表达者为62.5%,两者间差异有统计学意义( x 2=5.129, p <0.05)。TS和DPD的表达与化疗疗效存在负相关关系,TP的表达与化疗疗效存在正相关关系( r分别为-0.455,-0.413,0.408,p <0.05)。(5)胃癌组织中TS和TP的表达与采用5-FU为主方案化疗毒副反应间差异均无统计学意义( p >0.05),胃癌组织中DPD的表达与采用5-FU为主方案化疗毒副反应间比较差异均有统计学意义( x 2分别为37.499,44.897,34.061,19.772 ,p <0.01), Spearman等级相关分析显示胃癌组织中DPD的表达与5-FU为主方案化疗毒副反应间存在负相关关系( r分别为-0.578,-0.611,-0.567,-0.531,p <0.01)。(6)在随访的75例胃癌根治术患者中,术后发生复发转移42例,占56%,所有复发转移病例随访期间均死亡,平均生存期为39个月。复发转移者的TS、TP和DPD阳性表达率分别为78.57%(33/42)、78.57%(33/42)、85.71%(36/42),与未发生复发转移者的TS、TP和DPD阳性表达率比较,TS、TP阳性表达率在两组间比较差异有统计学意义( p分别为0.007,0.001),DPD阳性表达率在两组间比较差异无统计学意义( p >0.05)。Kaplan-Meier分析显示,75例患者平均生存期为48个月,95%CI为42.685～53.082,中位生存期为52个月,95%CI为47.046～56.954。1年生存率94.6%,3年生存率67.4%,5年生存率26.2%。单因素生存分析显示,TS阴性和阳性表达者的平均生存期分别为62个月和42个月,中位生存期分别为59个月和39个月,差异有统计学意义( x 2=7.800, p =0.005),TP阴性表达者与阳性表达者的平均生存期分别为65个月和37个月,中位生存期分别为52个月和35个月,差异具有统计学意义( x 2=27.080, p =0.000),DPD阴性表达者与阳性表达者的平均生存期分别为58个月和45个月,中位生存期分别为59个月和47个月,差异也具有统计学意义( x 2=4.305, p =0.038)。采用COX比例风险回归模型对总生存期进行分析显示,胃癌分期、淋巴结转移、TS的表达是独立预后因素,分期晚、伴淋巴结转移、TS阳性表达者生存时间短,预后差。(7)采用Spearman等级相关分析结果显示,TS和TP、TS和DPD、TP和DPD间均无相关性( r分别为0.073,0.023,0.043, p >0.05)。( 8)胃癌组织中TS和DPD的表达与MVD无相关性( r分别为0.064,0.010, p >0.05),TP阳性表达者MVD明显高于TP阴性表达者, t值为10.031,p <0.01,差异有统计学意义, Spearman等级相关分析显示胃癌组织中TP的表达与MVD存在正相关关系( r =0.737, p <0.01)。2蛋白免疫印迹实验部分:(1)胃癌组织中TS、TP和DPD的表达明显高于癌旁正常胃粘膜组织, t分别为-4.360,-4.224,-2.997,差异均有统计学意义, p分别为0.000,0.000,0.004。(2)TS的表达与胃癌淋巴结转移存在正相关关系( r =0.449, p <0.01);TP的表达与肿瘤分型、浸润深度、淋巴结转移、胃癌分期间存在正相关关系( r分别为0.337,0.493,0.471,0.377,p <0.05);DPD的表达与临床病理特征间差异均无统计学意义( p >0.05)。(3)TS和TP的表达与胃癌患者采用5-FU为主方案化疗毒副反应间差异无统计学意义( p >0.05);DPD的表达与胃癌患者采用5-FU为主方案化疗毒副反应间差异均有统计学意义( p <0.01),DPD的表达与恶心呕吐、骨髓抑制、腹泻及口腔黏膜炎均存在负相关关系( r分别为-0.883,-0.783,-0.494,-0.571,p <0.01)。(4)Spearman等级相关分析结果显示,TS和TP、TS和DPD、TP和DPD均存在正相关关系,r分别为0.683,0.527,0.577,p均为0.000。(5) IHC及western blot两种方法同时检测了TS、TP和DPD在胃癌组织中的表达,IHC检测TS、TP和DPD阳性表达者与阴性表达者的相对系数比较差异均有统计学意义( t分别为5.920,6.879,2.708, p分别为0.000,0.000,0.014)。分别以TS、TP和DPD相对系数的均数为界值将其分为低表达组和高表达组,经Kappa一致性检验分析表明:三种酶的Kappa值分别为0.802,0.794,0.794,均大于0.75,结果具有一致性。3高效液相色谱实验部分:(1) 66例胃癌患者外周血UH2/U即DPD活性呈正态分布,平均数为2.3109,中位数为2.2750,在不同患者的变异较大,标准差为0.86733,范围为0.47～3.96,无外周血UH2/U完全缺失者。(2)胃癌患者外周血UH2/U与采用5-FU为主方案化疗毒副反应间差异均有统计学意义( p <0.05),外周血UH2/U值与恶心呕吐、骨髓抑制、腹泻及口腔黏膜炎均存在负相关关系( r分别为-0.322,-0.651,-0.777,-0.745, p <0.01)。结论1胃癌组织中存在TS、TP和DPD蛋白的表达,且高于癌旁正常胃粘膜组织的表达,TS阳性染色定位于胃癌细胞的细胞浆和细胞核,TP和DPD主要表达于胃癌细胞的细胞浆,提示三种酶的表达与胃癌的发生有关。2 TS与胃癌患者是否发生淋巴结转移有关,是胃癌患者的独立预后因素和评定5-FU为主方案化疗敏感性的指标。3 TP的表达与胃癌血管生成、侵袭、转移密切相关,并可以作为判定5-FU为主方案化疗敏感性的指标之一。4胃癌组织中DPD的表达可作为评价胃癌患者5-FU为主方案化疗敏感性、化疗毒副反应的指标。5采用IHC和western blot两种实验方法在定性和定量水平上检测TS、TP和DPD的表达,结果一致。6胃癌患者外周血UH2/U值即DPD活性可以作为5-FU为主方案化疗毒副反应的预测指标,指导临床调整用药剂量。