研究背景:线粒体有它自己的遗传物质和遗传体系,是一种半自主的细胞器,它是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所,为细胞的活动提供能量。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度为20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子,通过和靶基因mRNA碱基配对引起沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。早期研究认为,miRNAs的工作场所仅为细胞质,调控着核编码的mRNA的翻译。近期研究表明,线粒体中也含有丰富的miRNA,这种线粒体定位的miRNA被称为mitomiRs,尽管其从细胞质进入线粒体的过程尚不清楚,但mitomiR以不同的方式参与调节线粒体内的蛋白质翻译过程,进而影响细胞的能量供应。目的:确定在压力后负荷造成的心力衰竭的大鼠模型中,有氧运动干预造成了mitomiR的变化;通过测序技术,发现若干新的mitomiR,进而讨论其调节线粒体能量代谢的可能作用。方法:1.动物模型的制备。选取雄性Wistar大鼠48只,随机分成两组,24只采取腹主动脉缩窄术提高大鼠心脏的后负荷,为腹主动脉缩窄手术组,简称手术组,记为A;24只仅剥离腹主动脉而不进行缩窄手术,为假手术组,记为S。术后8周,剔除造模失败的动物,将两组动物模型再随机分成两组,一组大鼠进行有氧运动训练8周,记为T。另一组大鼠使其安静自由运动,记为C。大鼠总分组即为:手术安静组(AC)、手术运动组(AT)、假手术安静组(SC),假手术运动组(ST)。2.大鼠心脏形态与功能检测。采用VisualSonics Vevo?2100小动物超声成像系统对所有存活动物模型进行心脏超声成像检测。主要指标:左心室收缩末期内径(LVIDs)、舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩期室间隔厚度(IVSs)、舒张期室间隔厚度(IVSd)、左心室收缩期心室后壁厚度(LVPWs)、舒张期心室后壁厚度(LVPWd)等维径指标以及射血分数(EF)、缩短分数(FS)等泵功能指标。3.超纯线粒体的制备。处死实验动物,取左心室,差速离心法提取粗制线粒体,Percoll密度梯度离心法制备超纯线粒体,以不同特异定位的蛋白及rRNA种类来判断线粒体的纯度。4.超纯线粒体RNA的制备。用Trizol法提取各组大鼠样本的超纯线粒体RNA,并用NaNodrop 2000测RNA浓度以及纯度。5.RNA高通量测序。每组随机抽选3个样本,采用small RNA文库的方式建库,进行RNA高通量测序。对各组大鼠心肌组织的线粒体中所检测到的所有核酸序列进行归纳整理,分为known miRNA和novel miRNA。6.生物信息学分析。对各组大鼠心肌线粒体的known miRNA的表达进行对比,分析计算出有规律有差异的miRNA。并对检测出的所有novel miRNA进行归纳总结,筛选出可能是miRNA的序列。7.SYBR Green qRCR Master Mix。检测即符合二级结构又有差异性表达的novel miRNA在H9C2细胞中的过表达效果。结果:1.对于高通量测序的4组大鼠心肌线粒体12个RNA样本中known miRNA数据进行生物信息学分析统计出known miRNA。一共鉴定出181个。经过严格筛选后发现:(1)AC组与SC组相比较,共有20种miRNA表达下调,36种miRNA表达上调。其中呈显著差异的只有rno-miR-99b-5p,表达上调。(2)AT组与AC组相比较,共有35种miRNA表达下调,22种miRNA表达上调,其中有显著性差异的有rno-miR-21-5p,其表达下调。2.对于高通量测序的4组大鼠心肌线粒体12个RNA样本中novel miRNA进行数据分析,一共检测到431个novel miRNA序列,经过初步筛选后得到412个。根据其测序丰度、组别之间的差异表以及二级结构图,最终筛选出7个核酸序列:NovelmiRNA-162、NovelmiRNA-223、NovelmiRNA-378、NovelmiRNA-207、NovelmiRNA-362、NovelmiRNA-211、NovelmiRNA-355。对其进行RT-qPCR的验证。最终得出NovelmiRNA-162、NovelmiRNA-378、NovelmiRNA-207、NovelmiRNA-362可能是定位在线粒体内并对心衰有影响的miRNA。结论:1.在有氧运动干预大鼠心衰模型中,确实存在线粒体定位的miRNA的改变。2.RT-qPCR对候选miRNA进行验证,最终得出NovelmiRNA-162、NovelmiRNA-378、NovelmiRNA-207、NovelmiRNA-362可能是定位在线粒体内并对心衰有影响的miRNA。