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目的：
1.通过对Y-盒结合蛋白1(YB-1)表达的检测，了解其在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的表达情况，探讨其表达与肿瘤细胞增殖、细胞耐药、化疗疗效及预后的关系；
2.构建YB-1特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体，并将YB-1shRNA导入耐药白血病细胞株K562/A02中，观察白血病细胞中YB-1基因表达下调后，白血病细胞的生物学行为的变化，探讨YB-1对白血病细胞生物学行为的影响及其机制。
方法：
1.采用Envision两步法检测DLBCL和反应性淋巴结增生(RLH)石蜡标本中YB-1、P-gp和肿瘤增殖相关抗原(PCNA)的表达，分析YB-1的核定位(活化)与细胞P-gp、PCNA的相关性，并探讨其与临床参数的关系；
2.把被9bp/芋列间隔的针对YB-1不同靶序列的三个19bp的反向重复序列及随机片段HK，插入携带人U6SnRNA启动子的pGensil-1质粒载体中，产生重组质粒pGensil-1/U6/vaxll，pGensil-1/U6/YBXl2，pGensil-lU6/YBXl3和pGensil-1/U6/HK,分别用Pst I和Sal I酶切鉴定，并将经酶切鉴定正确的重组质粒作测序分析；
3.采用脂质体介导的方法将已构建的人YB-1基因特异性shRNA及随机片段HK的真核表达载体转染进K562/A02细胞中，G418抗性筛选获得阳性克隆，RT-PCR和免疫印迹反应检测白血病细胞中YB-1mRNA和蛋白表达量的改变；采用苔盼兰拒染细胞直接计数法、MTT法和细胞周期测定分析YB-1基因对白血病细胞增殖的影响；AnnexinV检测白血病细胞的凋亡程度；采用NTT法检测转染前后化疗药物的ICso值变化，RT-PCR和流式细胞仪检测转染前后细胞中的mdrlmRNA和P-gp表达的变化；采用基因芯片技术比较阳性转染组与对照组细胞的基因表达的差异。
结果：DLBCL组与RLH组的YB-1胞浆阳性表达率无明显差异(P=0.763)，而DLBCL组的YB-1胞核阳性表达率明显高于RLH组(P<0.05)；DLBCL临床III～Ⅳ期、结外淋巴组织侵犯及骨髓浸润患者的YB-1胞核阳性表达率明显高于I～II期、结内病变及无骨髓浸润患者，差异有统计学意义(P<0.05)；DLBCL组与RLH组均出现P-gp的表达，两组的总体表达率无明显差异(P>0.05)，P-gp的表达强度与DLBCL患者的性别、年龄、临床分期、结内外浸润及有无骨髓浸润无明显相关性(P>0.05)；YB-1的核阳性表达与P-gp的表达强度(7=0.950，P=-0.005)及PCNA积分(γ=0.930，P=0.005)均呈正相关；化疗有效组的YB-1核阳性表达率明显低于化疗无效组(P=0.038)：化疗有效组的P-gp表达强度显著低于化疗无效组(P<0.00 1)。
针对YB-1第5外显子325-343、381-399和430-448位点设计的三个shRNA片段和随机片段HK成功克隆入pGenesil-1质粒中，产生重组质粒pGensil-1U6/YBXll，pGensil-1/U6/YBXl2，pGensil-1/U6/YBXl3及pGensil-1/U6/HK，酶切及DNA测序分析显示，重组质粒shRNA编码序列与设计片断的序列完全一致。成功构建了针对YB-1的特异性shRNA真核表达载体。
通过脂质体法将YB-1shRNA和HK重组载体转染进K562/A02细胞后，获5组细胞，依次为K562/A02、K562/A02-HK、K562/A02-YBX11、K562/A02-YBXl2和K562/A02-YBXl3。G418筛选2周后，流式细胞仪检测显示，阳性转染组和随机片段组荧光强度均明显高于未转染的K562/A02细胞，提示重组质粒获得较高转染率，5组细胞转染率依次为(0.13±0.06)％、(63.644±2.19)％、(54.444±1.12)％、(48.854±1.93)％、(62.254±1.13)％；RT-PCR法结果显示，随机片段组和未转染细胞YB-1基因表达量明显高于阳性转染的3组细胞，5组细胞以β-actin标化后的YB-1辉度值分别为1.224、1.173、0.426、0.889、0.399，YBX11、YBXl2和YBXl3对YB-1mRNA的抑制率分别为(65.14±2.1)％、(27.4±1.3)％和(67.44±1.6)％：Western blotting结果也显示，阳性转染组YB-1的蛋白条带强度比对照组细胞明显减弱，说明YB-1shRNA的导入有效地抑制了目的基因的转录与蛋白的表达；生长曲线提示阳性转染组细胞生长缓慢，细胞周期动力学分析示阳性转染组Gl期细胞增多，G2期与S期细胞显著减少p<0.05)，提示YB-1的表达可能参与细胞增殖的调节；在小剂量As203作用下，未转染组无明显凋亡，随机片段组与阳性转染组细胞均出现凋亡，AnnexinV检测结果显示，阳性转染组细胞的早期凋亡数量明显高于随机片段组和未转染细胞(P<0.05)，5组细胞的凋亡细胞数依次为(0.524±0.16)％、(19.144±2.26)％、(48.094±2.89)％、(45.894±0.46)％、(50.304±1.48)％，提示YB-1的表达可能部分地抑制了药物对细胞的诱导凋亡作用；MTT结果显示阳性转染组细胞的阿霉素IC50明显低于随机片段组和阴性对照(P<0.05)；RT-PCR结果显示，阳性转染组细胞中mdrl mRNA水平明显降低，5组细胞B-actin标化后的mdrl辉度值分别为0.868、0.889、0.321、0.684、0.226：流式检测P-gp表达结果示，阳性转染组P-gp的峰值较对照组明显左移，提示YB-l可能参与调节mdrl/P-gp所介导的多药耐药；基因芯片的结果提示YB-1基因表达沉默后，基因转录调节、蛋白翻译合成、细胞增殖、细胞凋亡、细胞的免疫调节、细胞信号和传递蛋白表达等均受到明显地影响。其中MAPKKKl3(丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶13)、PKC(蛋白激酶C)、RHOC(Ras同源基因家族成员C)、TGFA(转化生长因子)等基因表达下调，CARD8(Caspase相关因子8)、TRAF5(TNF受体相关因子5)等基因表达上调。
结论：
1.DLBCL中YB-1核阳性定位与P-gp的表达密切相关，YB-1核阳性定位及P-gp的高表达提示DLBCL患者预后不良。
2.转染YB-1特异性shRNA的真核表达载体能减少白血病细胞中YB-1的表达，减慢细胞生长，加速细胞凋亡；转染YB-1shRNA后的白血病细胞对化疗药物的敏感性增加。
综上，YB-1抑制白血病细胞的增殖，促进白血病细胞的凋亡，增加耐药白血病细胞对化疗药物的敏感性，针对YB-1的基因治疗可能逆转恶性造血系统肿瘤多药耐药的一条新途径。