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免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin (Ig)-binding proteins, IBPs)是细菌产生的能够与抗体结合的一类蛋白,在发病中发挥着重要的作用。其中最重要的三种代表分子为金黄色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcal protein A, SpA),链球菌蛋白G(Streptococcal protein G, SpG)和部分大消化链球菌表面蛋白L(Peptostreptococcus magnus protein L, PpL)。IBPs由多个高度同源的结合结构域头尾相连构成,每个结构域构成了与抗体结合的基本单位,保留了全部结合活性。本室应用噬菌体展示体外亲和筛选的进化方法获得了由SpA A结构域和PpL B3结构域串联而成的非天然存在的新型抗体结合分子AL(Novel evolved Ig-binding molecules AL, NEIBMAL,以下简称为AL), AL能够与人和哺乳动物的各类抗体Fab段的VH3重链和κ轻链同时结合,形成新的抗体结合模式。AL中,SpA A结构域与VH3结合活性远远低于PpL B3与κ轻链结合的活性。对AL的SpA中A结构域螺旋Ⅱ上的第27位和第34位氨基酸同时进行分子进化研究获得与人IgG和人IgM抗体结合活性明显增强的AL(VV)分子。然而,研究表明,AL(VV)主要通过增强SpAA中VH3结合界面的稳定性实现结合活性的提高,其结合位点并未增加。目的：构建AL和AL(VV)插入突变体噬菌体展示文库,应用人IgM进行分子进化筛选,获得结合活性增强的突变体,为病原体特异性抗体检测、抗体纯化和抗体吸附治疗的进一步改进提供研究基础。方法：1.构建AL和AL(VV)插入突变体噬菌体展示文库：应用PCR定点突变技术依次在AL中A结构域的螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ之间,即第38和第39位氨基酸之间插入3、5、7、9个氨基酸(amino acids, aa)大小的随机多肽构建多个AL插入突变体展示文库(库A3、库A5、库A7和库A9)；在AL(VV)中的A结构域的相同位置插入3个氨基酸大小的随机多肽,构建AL(VV)插入突变体噬菌体展示文库(库V3)。2.插入突变体噬菌体展示文库的体外进化亲和筛选：以人IgM为诱饵分子,通过重复的“吸附-洗脱-扩增”的过程,对库A3、库A5、库A7和库V3进行多轮筛选,PCR鉴定每代筛选过程中含插入片段的噬菌体与空载体的噬菌体比例的变化情况,当空载体完全消失后即达到进化完全；制备筛选后文库的单克隆噬菌体,应用噬菌体ELISA筛选IgM结合活性提高的单克隆噬菌体,并对高结合活性的噬菌体进行序列测定。同时,我们还对库A3和库V3进行了竞争性筛选和两轮常规性筛选后改为竞争性筛选的混合型筛选的研究。3.高结合活性插入突变体分子的原核表达、纯化及结合特性的分析：将抗体结合活性提高的插入突变体、AL和AL(VV)分别克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达质粒,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中。IPTG少量诱导表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析蛋白纯度,超微量核酸蛋白测定仪测定蛋白浓度。应用ELISA、竞争性ELISA、SPR等实验分析其与人IgG和人IgM结合特性。4.抗-HIV ELISA临床血清学检测：辣根过氧化物酶标记抗体结合活性提高的插入突变体和AL和AL(VV),用作酶标二抗,ELISA方法比较其抗-HIV的检测效果。结果：1.构建成功的4个插入突变体噬菌体展示文库：库A3、库A5、库A7和库V3的库容依次为3.2×106、2.04×106、1.8×106和3.1×106；滴度依次为2.3x10122.1×1012、1.9×1012和2.2×1012(TU/m1),能够满足后续的实验要求；由于库A9的库容量(0.9×105)一直不达标故弃用。2.库A3经过四轮常规分子进化筛选达到进化完全,挑取噬菌体ELISA结果中最高OD值的单克隆测序,获得插入突变体ALI37-KTS;库V3经过三轮常规分子进化筛选达到进化完全,挑高OD值单克隆测序测序,获得插入突变体AL(VV)I37-KNQ;库A5经过五轮常规分子进化筛选达到进化完全,并未出现高结合活性插入突变体分子；库A7经过五轮常规分子进化筛选达到进化完全,挑取噬菌体ELISA结果中最高OD值的单克隆测序,获得插入突变体ALI37-LTHQIST(在本次研究中并未进行深入研究)。库A3和库V3经过竞争性筛选后,挑取噬菌体ELISA结果中最高OD值的单克隆测序,在库A3中获得插入突变体ALI37-TNQ,库V3中获得插入突变体AL(VV)I37-NDD。库A3和库V3经过混合型筛选后,挑取噬菌体ELISA结果中最高OD值的单克隆测序,在库A3中获得插入突变体ALI37-NNN,库V3中获得插入突变体AL(VV)I37-NTQ。3.将这六种插入突变体分子克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,成功的构建了重组原核表达质粒pET32a-ALI37-KTS、pET32a-ALI37-TNQ、pET32a-ALI37-NNN、pET32a-AL(VV)I37-KNQ、pET32a-AL(VV)I37-NDD、pET32a-AL(VV)I37-NTQ以及pET32a-AL和 pET32a-AL(VV),大量诱导表达后得到八种纯度>90%的蛋白,八种蛋白浓度分别为8.47、7.23、6.7、5.4、7.8、5.33、5.75、4.3(mg/mL)。4.蛋白ELISA检测结果显示ALi37-KTS不、ALI37-TNQ、AL137-NNN与人IgG和人IgM的结合活性均高于AL,AL(VV)I37-KNQ、AL(VV)137-NDD、AL(VV)137-NTQ与人IgG和人IgM的结合活性均高于AL(VV)。库A3筛选得到的三种插入突变体进行相互之间的竞争性ELISA,结合活性的高低表现为：AL137-NNN最高,其次是AL137-TNQ,最低的为ALI37-KTS,与 ELISA结果相同。SPR检测的结果：亲和力最强的为AL(VV)I37-NTQ,其次是AL (VV) 137-NDD,最低的为AL (VV) I37-KNQ,亲和力均高于AL(VV)。5.八种蛋白AL、AL(VV)、ALI37-KTS、ALI37-TNQ、AL(VV)I37-KNQ、 AL(VV)I37-NDD和AL(VV)I37-NTQ辣根过氧化物酶(HRP)标记后获得HRP-AL、 HRP-AL(VV)、HRP-ALI37-KTS、HRP-ALI37-TNQ、HRP-ALI37-NNN、HRP-AL(VV)I37-KNQ、 HRP-AL(VV)I37-NDD和HRP-AL(VV)I37-NTQ。用ELISA方法比较其与人IgM和IgG的结合活性,结果显示HRP-ALI37-KTS、HRP-ALI37-TNQ、HRP-ALI37-NNN的结合能力均高于HRP-AL, HRP-AL(VV)I37-KNQ和HRP-AL(VV)I37-NTQ与人IgM和IgG的结合活性明显高于]HRP-AL(VV)。进而,我们用这8种酶标二抗对40份抗-HIV阳性临床血清标本和40份正常献血员血清标本进行抗-HIV ELISA检测显示：8种酶标二抗对40份抗-HCV阴性正常献血员血清标本的检出效果相当；在3种AL插入突变体中,仅HRP-ALI37-NNN对40份抗-HIV阳性临床血清标本的检出效果明显好于HRP-A L,显示出明显的统计学差异(P<0.001)；在3种AL(VV)插入突变体中,HRP-AL(VV)I37-KNQ和HRP-AL(VV)I37-ΠQ对40份抗-HIV阳性临床血清标本的检出效果明显好于HRP-AL(VV),显示出明显的统计学差异(P<0.001)。结论：本研究成功进行了对NEIBM AL分子的体外分子进化改造,获得了与人IgM和IgG结合活性明显提高的AL、AL(VV) 6种插入突变体分子,ALI37-KTS、ALI37-TNQ、 ALI37-NNN、AL(VV)I37-KNQ、AL(VV)I37-NDD和AL(VV)I37-NTQ。其中,HRP-AL137-NNN、 HRP-AL(VV)I37-KNQ和HRP-AL(VV)I37-NTQ能明显提高抗-]HIV ELISA的检测效果,显示出明确的应用前景。本研究同时也提供了一个应用分子进化手段改进蛋白分子功能的成功范例。