第一部分神经炎症对小鼠脑内自噬水平的调控及作用机制　　目的：本部分实验分别从生理及病理情况下诱导神经炎症，通过自噬相关标记物的测定研究神经炎症对小鼠脑内自噬水平的调控及作用机制。　　方法：在体实验分别构建了在脑内骨髓系细胞中特异性敲除 ikbkb基因的老年小鼠（18月龄）；以及在脑内髓细胞系中特异性敲除ikbkb，mapk14和myd88基因的年轻小鼠（3月龄），取同窝生的野生型小鼠作为对照。以细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为诱导病理情况下神经炎症的工具药。分别给予3月龄及18月龄C57BL6J野生型小鼠每隔两天一次的LPS（1mg/kg）腹腔注射，并持续注射1周，总共4次，并取同窝生的野生型小鼠注射PBS作为对照；用同样的方法处理脑内髓细胞系中特异性敲除ikbkb，mapk14和myd88基因的小鼠。荧光定量PCR检测小鼠脑内炎症因子tnf-?、l-1?及mcp-1的mRNA转录水平；Western blotting方法在蛋白水平检测脑内自噬相关蛋白 LC3B，Beclin1和 p62的表达量；分别使用Western blotting方法和组织免疫荧光标记的方法检测脑内海马区的Iba1蛋白的表达量及 Iba1阳性细胞数。离体实验构建了骨髓源性巨噬细胞与转染了自噬重组质粒的SH-SY5Y细胞共培养的观测体系，激光共聚焦观察经不同浓度、时间点处理后神经细胞内mRFP-GFP-LC3点状聚集情况。　　结果：　　1.衰老诱导的神经炎症对小鼠脑内自噬水平的影响：在脑内骨髓系细胞中特异性敲除IKK?蛋白的老年小鼠的神经炎症水平下调，自噬相关蛋白的表达同时出现下降。　　2.小胶质细胞 Toll样受体4激活对小鼠脑内自噬水平的影响：1）与接受 PBS注射的对照组相比，接受LPS注射的小鼠（3月龄及18月龄）脑内小胶质细胞炎性激活，脑内炎症因子tnf-?和 il-1?的mRNA转录水平显著升高，同时自噬相关蛋白LC3B，Beclin1表达水平升高，在老年小鼠中，LPS诱导LC3B-II增加的比率较年轻小鼠更多。2）与髓细胞内表达IKK?,p38?-MAPK和MyD88蛋白正常的小鼠相比，相应基因敲除的小鼠在接受 LPS注射后神经炎症水平有显著变化，而该变化与脑内自噬水平的变化一致。3）激光共聚焦观察转染了mRFP-GFP-LC3的SH-SY5Y细胞内GFP、RFP点状聚集在接受了巨噬细胞共培养条件下的LPS刺激后显著增加，该效果呈剂量依赖性地增强。　　结论：（1）衰老诱导的神经炎症与小鼠脑内自噬水平增加相关（2）LPS诱导的神经炎症与不同年龄小鼠脑内自噬水平增加相关。（3）接受 LPS处理后，不同炎症相关基因敲除小鼠的神经炎症变化水平与脑内自噬变化水平相关。（4）LPS诱导的髓细胞性炎症引起SH-SY5Y报告细胞自噬上调。本实验为探讨生理及病理不同情况下的神经炎症对神经自噬的影响提供了实验基础。　　第二部分长期低水平诱导的Toll样受体4激活通过自噬溶酶体途径降解异常磷酸化Tau蛋白　　目的：本部分实验观察低水平长期 TLR4激活诱导下的神经炎症对神经元自噬水平的影响，以及该处理对Tau转基因小鼠脑内异常磷酸化Tau蛋白的调控及其相关机制。　　方法：在体实验构建了过表达人源性P301S变异型微管相关Tau蛋白的转基因AD小鼠，以细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为诱导神经炎症的工具药。分别给予6月龄上述转基因小鼠每周一次LPS（0.15mg/kg）腹腔注射，持续注射12周，并取同窝生的转基因小鼠注射PBS作为对照。荧光定量PCR检测小鼠脑内炎症因子tnf-?、l-1?的 mRNA转录水平；组织免疫荧光标记的方法检测小鼠脑内小胶质细胞及星形胶质细胞蛋白标记Iba1和S100阳性的细胞数；Western blotting方法检测p65，ERK42/44，p38?-MAPK三种蛋白的磷酸化水平来评估该处理下的神经炎症诱导情况。使用Western blotting方法在蛋白水平检测脑内自噬相关蛋白 LC3B，Beclin1和p62的表达量；组织免疫荧光标记的方法检测小鼠大脑皮层内LC3A/B阳性细胞数。使用梯度萃取的方法检测不同组分中磷酸化Tau蛋白的含量，并使用Western blotting方法半定量分析；组织免疫荧光标记的方法检测小鼠大脑内 AT8免疫信号阳性的神经元数量。使用Western blotting方法在蛋白水平检测脑内激酶GSK3α/β和p38-MAPK的磷酸化水平；脑组织溶酶体成分纯化萃取法提取纯化溶酶体，并使用Western blotting方法检测溶酶体蛋白LAMP-1、磷酸化Tau及非溶酶体成分的calnexin和?-actin的蛋白表达量；激光共聚焦观察自噬囊泡标记物 p62及磷酸化 Tau共定位情况。使用Morris水迷宫实验测试Tau转基因小鼠接受不同处理后的行为学指标；组织免疫荧光标记的方法检测小鼠大脑突触蛋白标记物synaptophysin表达量；Western blotting方法检测突触结构蛋白PSD95和Munc18-1含量。离体实验构建了人源性ATG5显性失活突变及野生型质粒转染的SH-SY5Y细胞，Western blotting方法检测在骨髓源性巨噬细胞共培养体系中，接受LPS刺激后磷酸化Tau蛋白的含量。　　结果：　　1.长期低水平的 TLR4激活对小鼠脑内自噬水平的影响：长期低水平的 TLR4激活增强Tau转基因小鼠脑内自噬水平。　　2.长期低水平的TLR4激活对Tau转基因小鼠神经炎症的影响：1）与接受PBS注射的对照组相比，接受LPS注射的小鼠脑内小胶质细胞蛋白标记物Iba1表达增高，但通过Iba-1免疫荧光染色阳性的细胞数并未显著增加；星形胶质细胞数量通过计数S100阳性细胞也未发现有显著增加。2）接受LPS注射后小鼠脑内炎症因子tnf-?和il-1?的 mRNA转录水平也没有出现变化。3）炎症相关激酶 p65，ERK42/44，p38?-MAPK三者磷酸化水平在接受LPS注射后也均未有显著变化。4）接受LPS注射后小鼠体重无明显下降，也并未出现免疫耐受。上述结果充分表明，长期低水平的TLR4激活不会引起严重的神经炎症反应。　　3.长期低水平的TLR4激活对脑内异常磷酸化Tau蛋白的影响：与接受PBS注射的对照组相比，接受LPS注射的小鼠脑内异常磷酸化Tau蛋白含量在RIPA和甲酸组分中显著下降；AT8免疫信号阳性的神经元数量也明显少于PBS处理组。　　4.长期低水平的TLR4激活对脑内异常磷酸化Tau蛋白调控机制：1）长期低水平的TLR4激活并不影响激酶GSK3α/β和p38-MAPK的磷酸化水平，提示其并不影响磷酸化Tau蛋白的生成。2）长期低水平的TLR4激活促进脑内溶酶体形成，并促进异常磷酸化Tau蛋白进入溶酶体。3）自噬囊泡标记物p62及磷酸化Tau共定位提示异常磷酸化 Tau蛋白的确可以通过自噬溶酶体途径进行降解。4）ATG5显性失活突变SH-SY5Y细胞磷酸化Tau蛋白量在与巨噬细胞共培养体系中接受LPS刺激后无明显变化，而ATG5野生型含量下降提示炎症的确能通过自噬溶酶体途径降解异常磷酸化Tau蛋白。　　5.长期低水平的TLR4激活对Tau转基因小鼠AD相关症状的影响及机制：1）长期低水平的TLR4激活能改善Tau转基因小鼠的空间学习记忆能力。2）长期低水平的TLR4激活能减少小鼠神经元突触的损伤。　　结论：（1）长期低水平的TLR4激活增强小鼠脑内自噬。（2）长期低水平的TLR4激活不引起严重的神经炎症反应。（3）长期低水平的TLR4激活促进异常磷酸化Tau蛋白的降解。（4）自噬溶酶体介导了TLR4激活诱导的异常磷酸化Tau蛋白的降解。（5）长期低水平的TLR4激活改善Tau转基因小鼠AD相关症状。本实验发现长期低水平的神经炎症能通过增强自噬溶酶体功能途径增加对 AD转基因小鼠中具有神经毒性的异常磷酸化Tau蛋白的降解，该发现对更好地理解AD病理发生的相关机制提供了补充。