背景:尽管目前治疗冠状动脉疾病的方法已经有了显著的进步,但心肌梗死的发病率和死亡率始终居高不下,严重威胁着全球人类的健康。随着再生医学的不断精进,干细胞移植修复损伤心肌、促进心肌再生的功能已在大量动物模型中得以证实。与干细胞直接分化为心脏细胞系相比,研究人员更倾向于使用干细胞通过旁分泌效应发挥保护作用。这类旁分泌因子中就包含外泌体(exosomes)。尽管exosomes的具体功能尚未研究清楚,但可以明确的是,exosomes作为一种膜型载体,选择性的将mi RNA、m RNA和蛋白质等生物活性物质包裹在内,且经由供体细胞运输到至受体细胞,发挥生物学功效。实际上,在心血管疾病动物模型研究中,已经有大量报道干细胞来源exosomes可用于治疗急性心肌梗死、中风和肺动脉高压等疾病,功效显著。所以,外泌体的探究也许是治疗心血管疾病的最新以及最有价值的途径。然而,天然的,未修饰的外体在注入体内后迅速累积在肝脏,脾脏,肾脏和其他器官中。目标组织或器官很难集聚到有效的治疗浓度。面对这一挑战,在实验中我们尝试对exosomes进行结构上的改建,以期达到增强exosomes靶向缺血心肌组织的特异性,继而加强exosomes对缺血心肌的治疗功效。第一部分小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定和外泌体的提取和鉴定第一节小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的:从小鼠骨组织中抽提出可以多向分化的间充质干细胞(BMSCs),而且从其上清液中抽提出外泌体(exosomes)。方法:将C57BL/6小鼠骨髓细胞与骨碎片粘附培养,通过反复提纯后,对收获的细胞予以鉴定,包含:基本形态观察;流式检测法鉴别BMSCs特异性表面标志分子的表达;测绘BMSCs的生长曲线。结果:从骨髓和骨切片提取骨髓间充质干细胞5天融合度超过90%,形态相近,细胞间重叠生长,成团样生长时,对细胞传代。传代后,细胞的成长明显加快并且隔3-4天需传代1次。从第三代细胞中,细胞形态逐渐变为均匀的纺锤体或多角形纤维状细胞。流式细胞仪检测小鼠P3 BMSCs的细胞表型。结果提示祖细胞表面标志抗原高表达:Sca-1(93.79%),干细胞特异性表面标志物表达显示阳性:CD44(72.83%),CD105(31.82%),造血系特异性表面标志物阴性表达:CD45(0.64%),CD11b(0.5%),内皮细胞特异性表面标志物阴性表达:CD31(0.38%)。第3代骨髓间充质干细胞予以传代后,第1至2天是细胞生长的潜伏期,从第3天开始,细胞快速增值,从第4天至第6天增殖明显加速,为细胞的对数生长期。细胞培养从第7天起增殖速度高至顶峰继而平缓入平台期,细胞数目增殖显著减速,生长缓慢,要再次予以传代培养。结论:利用改良的全骨髓细胞加骨片贴壁法,从P3代以后可以获得纯度很高的小鼠BMSCs。第二节BMSCs来源外泌体的提取及鉴定目的:在第3代和第10代之间使用小鼠骨髓间充质干细胞,从其培养基上清液内抽提出圆形或椭圆形、大小不等和有特定表面标记物的外泌体,用作后续实验。方法:采用外泌体快速提取试剂盒,依照说明书从第3代至第10代的BMSCs培养基上清液中抽提出exosomes。使用BCA加强型试剂盒测算exosomes的浓度。从形态和粒径上鉴定exosomes:透射电镜检测exosomes的形态特征;纳米颗粒追踪技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)对exosomes的粒径进行测算;Western Blot判定外泌体表面上的标记分子CD63以及CD9的表达。结果:BCA增强型试剂盒测定exosomes的蛋白浓度,发现使用exosomes快速抽提试剂盒可从一个10cm培养皿的BMSCs上清中抽提出1000μg左右exosomes。在透射电镜下查看到不一样大小、圆形或椭圆形,有脂质膜结构的囊状小泡。通过纳米颗粒追踪分析测量exosomes大小分布,平均大小是134nm。Western Blot鉴定外泌体表面上的标记分子CD63以及CD9的阳性表达。结论:使用exo-quick试剂提取的exosomes浓度高。采用透射电镜、NTA和Western Blot鉴定,抽提物的形态与特征和exosomes相符。试剂盒提取exosomes简单、快捷、高效。第二部分小鼠心肌梗死模型的建立目的:构建稳定高效的小鼠急性心肌梗死(AMI)模型,分析研究模型构建的步骤和细节,为下一步探索BMSCs源性的exosomes治疗AMI的效果做好动物实验准备。方法:使用体重20g至25g的C57BL/6小鼠,随机设置成AMI组(10只)以及假手术组(10只)。AMI组予以气管插管下,钝性分离进胸腔,在直视环境下结扎心脏冠脉前降支(LAD)。鉴定心梗模型是否构建成功:小鼠冠脉在处理前后分别予以心电图检测;术前和术后第28天予以多普勒超声检测心功能;手术术后第28天杀死小鼠,拿出心脏制备冷冻切片或石蜡切片,予以HE染色及Masson’s Trichrome染色查看炎症以及纤维化状况。假手术组操作几乎与AMI组相同,只是没有予以冠脉的阻闭。结果:没有小鼠因大出血并发症死亡,AMI组存在1只小鼠术后低于恶性心律失常,存活率达到90%。两组鼠全部留观到术后的第28天,都存活。LAD阻断几秒后,阻断处下方的心肌由粉红色转为苍白色,局部室壁活动度减弱甚至消失。术后28天,AMI组心脏表面产生大量白色絮状物沉积,与胸腔严重黏连,梗死心肌颜色呈苍白色,心脏左心室明显扩大且形态不规则,缺血区的室壁变薄局部膨出呈室壁瘤,心脏与小鼠分离后,就会凹陷进心腔内。心电图在ST段可见I、II、III、a VF导联明显增高。AMI构建后第28天予以心脏超声检查,AMI组左室射血分数(EF)以及左室短轴缩短分数(FS)显著低于假手术组(P<0.01)。与假手术组比较,AMI组左室舒张末期内径(LVEDD)明显增加(P<0.01),左室收缩末期内径(LVESD)也显著增大(P<0.01)。苏木精-伊红染色观察AMI组心肌较多坏死,胶原纤维增生显著。Masson’s三色染色结果显示AMI组蓝染的胶原纤维有大量增殖,仅有少数粉红色正常心肌。结论:用这种方法构建的小鼠AMI模型简单。快捷、高效,小鼠存活率高,心梗指标显著,是一种很好的建模方法。第三部分构建靶向缺血心肌组织的外泌体目的:构建特异性靶向缺血心肌的外泌体。方法:通过分子克隆技术,将靶向缺血心肌组织的多肽优化序列插入到exosomes表面普遍富集的跨膜蛋白Lamp2b基因序列上,并克隆到质粒载体上。用高度表达靶向肽的质粒协同辅助包装体系一起转染293T细胞,抽提纯化慢病毒,感染BMSCs。从培养BMSCs的上清液中分离纯化exosomes,这些exosomes即有靶向肽展示在其表面。结果:通过比对基因序列,确认靶向肽序列成功插入到了Lamp2b上。使用倒置荧光显微镜,检测慢病毒感染BMSCs的功效,结果显示BMSCs的感染效率可在90%以上。2%琼脂糖凝胶电泳结果表明插入到靶向肽的外源Lamp2b基因高度表达,提示Lamp2b+靶向肽基因序列成功整合到了BMSCs基因上。经透射电镜、纳米颗粒跟踪分析技术检测高表达靶向肽的exosomes在形态和大小上与天然exosomes无显著差异。结论:通过分子克隆技术和慢病毒包装技术,可以实现将靶向缺血心肌组织的多肽展示在exosomes表面的目的。第四部分靶向缺血心肌组织的外泌体用于治疗心肌梗死的研究目的:使用骨髓间充质干细胞来源的靶向缺血心肌组织外泌体治疗心肌梗死,观察其体内、体外的靶向性及心肌保护的功能。方法:将缺氧损伤的H9C2细胞与靶向exosomes(IMTP-Exosomes,IMTP-Exos)和对照外泌体(Blank-Exosomes,Blank-Exos)共培养后,进行流式检测,观察H9C2细胞融合内吞两种exosomes的情况。Di O荧光染料标记的缺氧损伤的H9C2细胞与Di I标记的IMTP-Exos和Blank-Exos共培养,倒置荧光显微镜显示H9C2细胞识别以及内吞两种exosomes的状况。Di R标记BMSCs来源的两种exosomes,小鼠心梗模型建立成功第3d,经尾静脉注射,使用IVIS Spectrum小动物体内成像系统观察exosomes在体内的荧光分布。注射后72h后,取出小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏,用IVIS Spectrum小动物体内成像系统观察这些脏器中的exosomes荧光分布。另外建立一批心梗小鼠,尾静脉注射了Di I荧光染料标记的exosomes,72h后处死小鼠心脏被移出并制成冷冻切片。倒置荧光显微镜查看Di I标记exosomes在心梗部位的分布。成功构建小鼠心梗模型之后,尾静脉推注PBS、未改建exosomes和靶向exosomes,制备小鼠心脏的冰冻组织切片,予以HE染色、巨噬细胞极化反应检测,并提取小鼠心梗后心脏的总RNA,经RT-q PCR反应,检测IL-6、TNF-α和IL-1β,观察PBS和两类exosomes对心梗部位炎症反应的影响。或制作心脏石蜡切片,进行Masson’s Trichrome染色,免疫荧光染色检测BSI-lectin和α-SMA和TUNEL染色,观察PBS和两类exosomes对心肌梗死后纤维化、血管生成和心肌细胞凋亡的影响。术后28d予以彩色多普勒超声心动图检测,研究三种处理方式对小鼠心功能会产生何种影响。结果:两种Di I标识的exosomes与缺氧损伤的H9C2细胞予以共培养2h后,然后予以流式细胞术,结果发现IMTP-Exos相较于Blank-Exos能更多、更有效的被损伤的H9C2细胞识别内吞。将Di O荧光染料标记的缺氧损伤的H9C2细胞与Di I标记的IMTP-Exos和Blank-Exos共培养30min或60min后,倒置荧光显微镜观察发现,直至60min也只有少量的Blank-Exos被损伤的H9C2细胞识别融合内吞。而相反的,从30min时起,就已经有多量IMTP-Exos被损伤的H9C2细胞识别融合内吞,并且随着时间的延长,直至60min,不断有更多的IMTP-Exos被损伤的H9C2细胞识别融合内吞。将缺氧损伤的H9C2细胞与IMTP-Exos和Blank-Exos共培养2h后,TUNEL检测结果发现与对照组Blank-Exos相比,IMTP-Exos能够减少H9C2的凋亡,然而量化结果却并未显示组间差异具有统计学意义。小鼠活体成像荧光示踪可以看出,小鼠尾部首先出现强荧光信号,随后腹部和胸部荧光信号逐渐增强,0.5、2和12h时间点可以观测到IMTP-Exos的荧光信号相较于Blank-Exos更快趋向于小鼠的胸部。荧光信号在第二天达到最高值,并在第三天起逐渐淬灭。72小时后处死小鼠,迅速取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏,测量荧光信号的分布强度,两类exosomes在各个脏器集聚的荧光信号强度没有明显差异,然而在心脏梗死的部位,IMTP-Exos的荧光信号强度明显高于Blank-Exos,且组间差异有统计学意义(P<0.05)。相较于Blank-Exos,小鼠心梗区域内有更多的Di I标记的IMTP-Exos(红色点状)积聚。对荧光信号强度进行定量分析,IMTP-Exos组的荧光信号明显高于Blank-Exos组(P<0.001)。HE染色、巨噬细胞极化反应和RT-q PCR结果均提示IMTP-Exos能显著抑制心梗后的炎症反应。Masson’s Trichrome染色,免疫荧光染色检测BSI-lectin和α-SMA和TUNEL染色结果发现IMTP-Exos可以显著抑制心肌梗死后的纤维化、促进血管生成并抑制心肌细胞凋亡。多普勒超声仪器检测结果表明IMTP-Exos可以明显提高心肌梗死后的心脏功能。结论:IMTP-Exos在体内能更快、更多、更有效的靶向缺血心肌组织,并发挥抑制炎症、纤维化和心肌凋亡,促进血管再生,改善心功能。