论文部分内容阅读
目的:构建2条由pSIREN-RetroQ-ZsGreee(pRZ)质粒载体介导MDR1短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,针对MDR1基因过度表达机制,研究干扰片段逆转肾癌细胞ACHN多药耐药的可行性。方法: 1 )分别针对MDR1基因的两个不同位点,按BarnH I+Sense+Loop+Antisense+终止信号+ EcorI结构合成编码shRNA的DNA序列及其反义序列,退火连接及磷酸化形成双链后将其依次连入pRZ载体,构建成能产生MDR1短发卡RNA的质粒。2)体外培养肾癌细胞ACHN,采用脂质体介导的基因转染方法,将构建的质粒转染入ACHN。3)MTT法测定细胞对化疗药物阿霉素(ADM)的敏感性,免疫组织化学检测细胞膜表面P-gp表达,半定量RT-PCR检测MDR1基因的表达.4)采用spss16.0统计软件进行分析处理,数据均采用x±S表示,组间比较均采用两样本配对t检验,P<0.05表示差异有显著性。结果:构建成的质粒pRZ-A、pRZ-B(pSIREN-RetroQ-ZsGreee-A和pSIREN-RetroQ-ZsGreee-B)经酶切与测序证实构建成功,无任何碱基突变;荧光倒置显微镜观察并计数转染pRZ-A和pRZ-B后24h、48h、96hACHN绿色荧光蛋白表达,其中转染48h的绿色荧光蛋白表达最强,转染效率分别为75.35±1.15%、74.83±1.37%;MTT显示转染后的ACHN显著提高了对化疗药物ADM的敏感性,ACHN空白对照组的IC50约为2.5ug/ml,转染pRZ-A、pRZ-B ACHN IC50分别下降为0.65ug/ml、0.7ug/ml,较空白对照组分别下降了83.44%和83.42%;免疫细胞化学显示细胞表达P-gP水平明显降低,转染pRZ-A 96h细胞P-gp的阳性表达率与空白对照组有差异显著性(t=15.621 P<0.05),下降了44.69%。转染pRZ-B 48h(t=2.415)和96h(t=17.995)的细胞P-gp的阳性表达率与空白对照组有显著性差异(P<0.05),分别下降了7.32%和53.62%;半定量RT-PCR检测转染pRZ-A、pRZ-B MDR1 mRNA基因表达显著降低,与未转染ACHN相比,分别下降了82.5%和77.5%;统计学分析2条序列抑制MDR1基因表达差别无显著性(p>0.05)。结论:成功构建了能表达MDR1 shRNA的质粒载体pRZ-A和pRZ-B;其能有效地逆转肾癌耐药细胞ACHN的多药耐药,提高ACHN对ADM的敏感性,抑制P-gp介导的多药耐药。