【摘 要】
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目的:人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）感染是全球性的公共卫生问题之一。HCMV可导致健康人群潜在感染,并对胎儿生长发育构成威胁,造成新生儿先天性感染。为设计新型合成型HCMV疫苗,需要了解B、T细胞抗原表位在适应性免疫中发挥的重要作用。本研究通过使用生物信息学手段预测具有免疫激活功能的抗原表位,在体内和体外水平上验证其具有协助改善机体的免疫反应的能力,为开发疫
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目的:人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）感染是全球性的公共卫生问题之一。HCMV可导致健康人群潜在感染,并对胎儿生长发育构成威胁,造成新生儿先天性感染。为设计新型合成型HCMV疫苗,需要了解B、T细胞抗原表位在适应性免疫中发挥的重要作用。本研究通过使用生物信息学手段预测具有免疫激活功能的抗原表位,在体内和体外水平上验证其具有协助改善机体的免疫反应的能力,为开发疫苗寻找合适的抗原表位提供参考。方法:本实验利用生物信息学方法,预测HCMV中gB和pp150两种蛋白可能的B、T细胞抗原表位,并分别通过体外巨噬细胞体系、免疫小鼠检测预测抗原的提呈效果和免疫原性从而进行免疫效果评价。首先,在Genebank数据库中检索AD169、Towne和Toledo 3种毒株的核苷酸和氨基酸序列并下载序列信息,利用在线工具Mult Alin以及MEGA 7和Gene Doc软件对毒株的序列进行同源性分析。利用在线工具Prot Param、Prot Scale、TMHMM和Protean等软件综合分析预测2种蛋白的B细胞抗原表位,利用SYFPEITHI、IEDB、Net MHC II pan、Net MHC II 4种在线软件预测2种蛋白潜在的CD4+T细胞抗原表位,运用SYFPEITHI、IEDB、Net MHC在线软件预测2种蛋白潜在的CD8+T细胞抗原表位。将预测的B、T细胞抗原表位利用化学法合成多肽用于体内及体外效果评价。为确定构建巨噬细胞体外模型的最佳条件,使用50ng/ml、100 ng/ml、150 ng/ml和200 ng/ml不同浓度佛波酯（Phorbol myristate acetate,PMA）处理U937细胞24h或者48h,显微镜下观察细胞贴壁情况,流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞表面CD11b的表达情况,CCK-8法检测PMA对细胞的毒性作用。将50μg/ml的多肽单独作用于巨噬细胞,处理24h后通过流式细胞术检测细胞表面CD86的表达以确定是否能够被巨噬细胞识别并发挥抗原提呈作用。动物实验中,将只含有生理盐水的组设为阴性对照组,含有生理盐水和佐剂的组设为佐剂对照组,将含有多肽+佐剂或病毒+佐剂的组设为实验组,含有鸡卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）和佐剂的组设为阳性对照组。50μl的B、T细胞抗原表位与50μl弗式佐剂通过肌肉注射联合免疫小鼠,免疫三次后取小鼠脾细胞,通过流式细胞技术检测CD3+CD4+T细胞的白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）的表达以及CD3+CD8+T细胞的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IFN-γ的表达情况。结果:通过对比发现,AD169、Towne和Toledo 3种HCMV病毒株的氨基酸和核苷酸序列一致度均可达到90%以上,同源性较高,据此选择AD169株的氨基酸序列作为B、T细胞抗原表位预测的参照。预测的gB蛋白B细胞抗原表位区域为406～421和449～464,pp150蛋白B细胞抗原表位在535～550、633～648、673～688、880～895、659～674、290～305、821～836区域;gB蛋白的CD4+T细胞抗原表位在124～138和294～308区域,CD8+T细胞抗原表位在69～77区域;pp150蛋白的CD4+T细胞抗原表位在2～16和311～325区域,预测的CD8+T细胞抗原表位在311～319区域。将预测得到的细胞抗原表位进行合成用于后续实验。构建体外巨噬细胞模型时,100ng/ml及以上浓度的PMA处理U937细胞表面CD11b表达显著升高,CCK-8检测发现PMA处理48h细胞活性显著增强,且在50ng/ml和100ng/ml PMA处理细胞48h时细胞活性达到最强。合成的多肽（B2～B7、B9、T1、T3～T6）以终体积浓度50μg/ml刺激巨噬细胞24h时细胞表达的CD86与对照组相比均有明显差异。在动物实验中,gB蛋白或pp150蛋白组与单纯佐剂组相比可以有效激活CD3+CD4+T细胞分泌IL-4和IFN-γ,同时可以刺激CD3+CD8+T细胞产生新的亚群并分泌IFN-γ和TNF-α。结论:本研究成功地利用生物信息学工具预测出了gB和pp150蛋白的B、T细胞抗原表位,并且在细胞水平和动物水平上鉴定其具有一定免疫原性,为HMCV疫苗的抗原表位研究提供一定的参考。
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