山羊胎儿背最长肌发育过程中lncRNAs的鉴定及其功能验证

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:zhsotanlb
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产肉性状作为影响肉羊生产效益的重要经济性状,一直是肉羊遗传育种研究领域关注的热点。肌肉生长的分子调控机制解析是肉羊分子育种改良的突破口。山羊的骨骼肌生长发育过程受到多种调节因子的共同作用,以往的相关研究主要集中在DNA、mRNA和miRNA层面,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)对山羊骨骼肌,尤其是山羊胎儿期生长发育的调控研究还未见报道。基于此,本研究以简州大耳羊胎儿发育不同阶段(妊娠期45d、60d和105d)及出生3d羔羊的背最长肌组织为研究材料,利用RNA-seq技术鉴定lncRNA转录本及其基因组特征,筛选在山羊不同发育阶段骨骼肌组织中差异表达的lncRNAs,并对其功能进行预测;在细胞水平对lnc6810促进山羊骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells,SMSCs)分化的作用机制进行了解析,主要研究结果如下。1.在所有11个cDNA测序文库中总共获得约131 Gb读长平均为125 bp的双末端原始读段(raw reads),平均每个文库获得11.97±1.87 Gb的raw reads。其中约有98.20%的raw reads达到质控标准被保留下来作为高质量读段(clean reads)。经TopHat2软件比对78.99%-87.73%的clean reads可以比对到山羊基因组上(NCBI,CHIR1.0),其中78.52%-86.60%的序列具有唯一的基因组位置。在每个测序文库中平均拼接出51,053(48,39853,266)条转录本,平均覆盖了80.41%(75.88%85.10%)的山羊参考转录组已注释的转录本,并且每个文库中覆盖度为90%以上的转录本约占总转录本数的51.44%。2.共鉴定出3,981个可靠的lncRNA转录本,包括3,515个基因间lncRNAs和466个反义lncRNAs。相比蛋白编码基因,鉴定出的lncRNA具有更少的外显子数,更短的转录本长度和更低的蛋白编码潜能。共有577个lncRNAs的表达量在不同发育阶段两两之间存在显著差异;没有发现发育时期特异性表达的lncRNA,但是有154个差异表达的lncRNAs在四个发育阶段均检测出。3.在lncRNA的功能预测中,lncRNA的cis和trans靶基因的GO和KEGG pathway富集分析中,发现了很多蛋白编码基因富集到转录调控和肌肉发育相关的生物学过程条目以及信号通路,表明lncRNA可能通过影响这些蛋白编码基因的表达参与到肌肉发育的生物学过程中。4.利用qPCR验证了RNA-seq测序的lncRNA表达量结果,发现两种定量结果在不同发育阶段的表达变化趋势一致,且两种方法所得到的结果有很高的相关性(r=0.940.98),表明RNA-seq测序结果具有可靠性。5.通过RegRNA2.0软件和miRBase数据库的综合分析,预测了lnc6810的序列上可能存在chi-miR-125b的结合位点。利用双荧光素酶报告系统验证lnc6810和chi-miR-125b的结合作用发现,和对照组细胞相比,miR-125b mimics与野生型重组质粒共转染的细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而miR-125b mimics与突变型重组质粒共转染的细胞荧光素酶活性没有显著影响,结果表明lnc6810是chi-miR-125b作用的靶标。荧光原位杂交试验表明,lnc6810主要定位在细胞质中。6.在山羊SMSCs分化过程中,lnc6810的表达量呈现上调趋势,miR-125b的表达量呈现下调趋势。lnc6810过表达后,miR-125b表达量下调,肌细胞分化标志基因MyoD和MyoG以及IGF-2基因表达上调;lnc6810表达被干扰后,miR-125b表达量上调,肌细胞分化标志基因MyoD和MyoG以及IGF-2基因表达下调。这些结果表明,lnc6810能够作为竞争性内源RNA吸附miR-125b,缓解miR-125b对其靶基因IGF-2的抑制作用,从而增加细胞中IGF-2基因的表达量,促进了山羊SMSCs的分化。7.miR-125b过表达后,肌细胞分化标志基因MyoD和MyoG以及IGF-2基因表达下调,lnc6810表达量下调;抑制miR-125b表达,肌细胞分化标志基因MyoD和MyoG以及IGF-2基因表达上调,lnc6810表达量上调。这些结果表明,miR-125b能够抑制SMSCs的分化,同时也证明了在山羊SMSCs分化过程中,lnc6810能够作为竞争性内源RNA发挥作用。本研究通过对山羊胎儿发育过程中骨骼肌组织lncRNAs的筛选鉴定以及lnc6810-miR-125b-IGF2调控网络的解析,为深入揭示山羊骨骼肌发育过程中的分子机制提供了参考依据。
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