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肌肉是畜禽胴体中最主要的组成部分,了解调控肌肉生长发育的机制对畜禽生产具有重要的意义。肌肉含量主要由三个因素决定:肌纤维数量、肌纤维直径以及肌纤维类型,目前研究发现家禽的肌纤维数量在胚胎发育阶段基本固定。原代成肌细胞是肌肉发育的一种前体细胞,在胚胎期骨骼肌生长发育过程发挥关键作用,而非编码RNA又是参与原代成肌细胞发生和发展过程的关键调控因子。课题组前期通过RNA-seq测序分析发现miR-7在鸡原代成肌细胞的增殖期(GM)高表达,在分化期(DM)表达持续下降,而FSTL1和KLF4基因表达趋势与miR-7正好相反,它们可能在胚胎期骨骼肌生长发育过程发挥作用。本研究主要围绕miR-7和KLF4基因的关系,以及miR-7和KLF4基因在鸡原代成肌细胞(CPMs)生长发育过程中的作用展开一系列试验研究,主要结果如下:1.在胚胎期胸肌和腿肌中miR-7表达趋势一致,表达水平先下降后持续上升,1日龄达到最高水平;在1日龄组织中,miR-7在肺和小肠组织中的表达量显著高于胸肌组织(P<0.05);在诱导分化的CPMs中miR-7表达水平呈现先升高后下降,且从DM1到DM3表达量显著上升(P<0.05);通过CGK-8、流式细胞术和Edu检测发现过表达miR-7极显著降低了 CPMs的增殖效率(P<0.01),使进入G0G1期的细胞数目增多,进入S期细胞数目减少,抑制了 CPMs的增殖;干扰miR-7极显著增加了 CPMs的增殖效率(P<0.01),使进入G0G1期的细胞数目减少,进入S期的细胞数目增多,促进了 CPMs的增殖。通过RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光试验发现过表达miR-7显著下调了分化标志基因MYHC、MYOG和MYOD1的表达,上调了 MSTN基因的表达,同时抑制了 MYHC和MYOD1蛋白的表达;极显著减少了肌管面积(P<0.01),抑制了 CPMs的分化;而干扰miR-7会显著增加肌管面积(P<0.05),促进CPMs的分化。综上所述,miR-7表达会抑制胚胎期骨骼肌肌纤维的生长发育,在肌肉发育过程发挥重要的调控作用,为后期研究京海黄鸡的肌肉生长提供借鉴意义。2.通过RT-PCR检测干扰和过表达miR-7后6个凋亡标志基因RAF1、Cytc、Fas、Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9 mRNA的表达变化。试验结果表明过表达miR-7显著上调了 RAF1、Cytc、Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9等5个凋亡标志基因的表达水平(P<0.05);干扰miR-7则显著或极显著下调了这6个凋亡标志基因的表达水平(P<0.05或P<0.01)。流式细胞术检测CPMs凋亡,结果表明过表达miR-7会促进成肌细胞凋亡过程的发生,干扰miR-7后会抑制成肌细胞凋亡过程的发生。综上所述,miR-7的表达会促进CPMs凋亡过程的发生。3.通过RNA-seq数据分析,并采用miRanda软件和miRBase数据库等预测发现了miR-7的两个候选靶基因FSTL1和KLF4。双荧光素酶试验检测结果表明miR-7与FSTL1基因不存在靶向关系(P>0.05),miR-7和KLF4基因存在靶向关系(P<0.01);RT-PCR检测结果表明miR-7和KLF4基因在胚胎期骨骼肌中的表达趋势存在负相关关系;过表达miR-7显著下调了 KLF4基因的表达,干扰miR-7显著上调了 KLF4基因的表达。此外,在挽救试验中,CCK-8检测结果表明同时转染miR-7 mimic和pcDNA3.1-KLF4组的增殖效率最高;同时通过RT-PCR进一步检测6个凋亡标志基因的表达,结果表明miR-7和KLF4基因存在负调控关系。综上所述,KLF4基因是miR-7的靶基因,且两者在鸡成肌细胞增殖和凋亡过程中存在负相关。4.在胚胎期胸肌和腿肌中KLF4基因表达趋势一致,KLF4表达水平先下降后略微升高,且E12时表达水平最高;在1日龄组织中,KLF4基因在胸肌和腿肌中的表达量显著高度其他组织中的表达量(P<0.05);与增殖期相比(50%),随着成肌细胞诱导分化KLF4基因的表达水平不断的显著升高。干扰KLF4基因极显著降低了 CPMs的增殖效率(P<0.01),使进入G0G1期的细胞数目增多,进入S期的细胞数目减少,抑制了分化标志基因MYHC、MYOG和MYOD1的表达(P<0.05),上调了 MSTN基因的表达(P<0.05),同时抑制了 MYHC和MYOD1蛋白的表达,使肌管面积极显著减少(P<0.01),抑制了 CPMs的增殖和分化。过表达KLF4基因极显著提高了CPMs的增殖效率(P<0.01),使进入G0G1期的细胞数目减少,进入S期的细胞数目增加,显著上调了分化标志基因以及相关蛋白的表达,下调了 MSTN基因的表达,使肌管面积显著增加(P<0.05),促进了 CPMs的增殖和分化。综上所述,KLF4基因的表达会促进鸡胚胎期骨骼肌肌纤维的发育,是肉鸡肌肉生长发育过程中一个重要的调控因子。