细菌通过分泌各种各样的蛋白进入胞外环境介导其与周围环境之间的相互作用。细菌至少进化出七种专门的分泌系统来完成这个任务。通过这些复杂且遗传各异的分泌系统一次可分泌出一组蛋白离散集群。VI型分泌系统（T6SS）就是其中的一种分泌系统,它是一种接触依赖性的蛋白分泌途径,负责投递毒素效应蛋白进入细菌和真核靶细胞。T6SS广泛分布于革兰氏阴性细菌。在铜绿假单胞菌PAO1中存在三套独立的T6SS,分别称为H1,H2,和H3-T6SS。最近的研究显示,H1-T6SS作用于原核细胞,而H2-T6SS和H3-T6SS则同时介导铜绿假单胞菌与原核和真核细胞之间的相互作用。然而,T6SS结构组分的具体功能仍然不清楚。胞内增值因子（IcmF）家族蛋白就是所有的不同病原细菌T6SS的保守结构组分。生物信息学分析揭示铜绿假单胞菌PAO1的IcmF3与其他IcmF同源蛋白不同,它可能代表一类之前没有描述过的独特的IcmF新功能分枝。为此,我们研究了铜绿假单胞菌IcmF3的功能。本研究的结果显示基因缺失icmF3使铜绿假单胞菌PAO1出现多种表型改变。icmF3基因突变造成铜绿假单胞菌PAO1出现菌落形态变异和在限铁培养条件下生长加快的表型。然而,令人意外的是icmF3突变株还显示出铁载体脓青素合成缺陷,泳动性减弱和对秀丽隐杆线虫毒力减弱的表型。同时,icmF3突变株相比野生型菌株还显示出具有更高的接合频率和更强的在非生命体表面形成生物膜的能力。此外,icmF3突变通过诱导两个哌嗪生物合成基因簇的表达而导致铜绿假单胞菌绿脓菌素的过量合成。最后,icmF3突变导致铜绿假单胞菌对妥布霉素和庆大霉素等氨基糖苷类抗生素的抗性增强。而且所有检测到的icmF3突变株的表型均能通过互补野生型icmF3基因而得到完全回复或部分回复。icmF3突变产生的多重表型效应表明icmF3基因在铜绿假单胞菌PAO1的致病和环境适应方面起重要作用。icmF3突变产生的多重表型效应也暗示H3-T6SS也许在铜绿假单胞菌PAO1的致病和环境适应方面起重要作用。先天性免疫和特别专一的吞噬细胞是宿主控制铜绿假单胞菌感染的关键因素。先天性免疫系统攻击铜绿假单胞菌的两个重要手段是限制铁的可得性和合成高毒性的活性氧自由基（ROS）。本研究揭示了H3-T6SS基因簇在铜绿假单胞菌PAO1克服宿主铁扣押屏障方面起重要作用。生物信息学分析T6SS效应蛋白在铜绿假单胞菌PAO1基因组中的分布情况预测了包含MORN₂结构域的PA2374蛋白可能是H3-T6SS的一个新的效应底物。然后本研究的结果证实了这一推测,PA2374确实是H3-T6SS的一个效应蛋白。然而,H3-T6SS结构基因的突变却不能完全抑制PA2374和Hcp3的分泌,这表明在铜绿假单胞菌PAO1中可能还存在其他能够识别PA2374和Hcp3的分泌系统。细菌双杂交和GST pull-down的结果显示Hcp3或Vgr G3直接与PA0095存在相互作用,而PA2374与PA0095存在间接性相互作用,这表明PA2374和Hcp3的分泌可能需要PA0095的参与,然而编码Vgr G1b蛋白的PA0095的分泌却不依赖于铜绿假单胞菌中的任何一套T6SS。紧接着,GST pull-down和ITC的结果显示PA2374能够结合PQS和直接与Fpt A或Opr F存在相互作用。进一步研究显示H3-T6SS基因簇的表达受破坏铜绿假单胞菌胞内铁稳态的诱导,且PA2374通过介导PQS-Fe通过外膜蛋白Fpt A和Opr F向铜绿假单胞菌胞内的运输而参与铜绿假单胞菌PAO1的铁摄取。而这个过程可能依赖于外膜囊泡,它作为PA2374和PQS-Fe在胞外环境的运输工具。竞争感染结果显示H3-T6SS和PA2374在铜绿假单胞菌PAO1克服宿主铁扣押与清除屏障方面起重要作用。本研究还显示H3-T6SS基因簇在铜绿假单胞菌PAO1克服产生高毒性活性氧自由基（ROS）的宿主防御方面起重要作用。LC-MS和β-半乳糖苷酶实验的结果显示在富铁培养条件下铜绿假单胞菌PAO1菌株中PQS的合成受H3-T6SS基因簇的抑制,而这种抑制作用在铁饥饿培养条件下得到解除。反过来,PQS则差异调控铜绿假单胞菌H3-T6SS结构基因和效应蛋白基因PA2374的表达。PA2374的表达受PQS的抑制,而H3-T6SS结构基因的表达受PQS的正调控。进一步研究显示,H3-T6SS通过参与抑制胞内ROS形成而具有抗H2O2胁迫的功能,然而却不影响铜绿假单胞菌对其他氧化剂的抗性。同时,研究还显示H3-T6SS的表达不受H2O2胁迫应激诱导和Oxy R的调控而受Rpo S的正调控。此外,我们利用定量蛋白组技术比较了铜绿假单胞菌PAO1菌株与clp V3突变株之间蛋白表达的差异。结果发现两个与PQS合成相关的蛋白以及许多抗氧胁迫相关的蛋白在clp V3突变株中表达上调。clp V3突变还导致铜绿假单胞菌中两个主要的储铁蛋白Bfr A和Dps的表达下调而负责将储铁蛋白中的铁释放出来的铁氧化还原蛋白NADP还原酶（Fpr）的表达则上调。进一步研究显示PQS缺陷突变和过表达dps均能有效回复H3-T6SS突变株对H2O2的敏感表型。最后,本研究提出一个H3-T6SS促进铜绿假单胞菌抗氧胁迫的作用机制:铜绿假单胞菌H3-T6SS通过抑制PQS的合成而导致胞内储铁蛋白Dps和Bfr A的表达上调同时抑制Fpr的表达,进而抑制胞内游离铁的形成,从而抑制了胞内Fenton反应的发生和高毒性ROS的产生。