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研究背景和目的
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromaltumor，GIST)是胃肠道最常见的间质肿瘤，占所有胃肠道间质肿瘤的80％，占所有胃肠道恶性肿瘤的0.1％至3％。传统观念认为，胃肠道间质瘤属于肉瘤范畴，对放疗不敏感。但近年来，国内外已有越来越多的案例报道表明，GIST并非普遍具有放射抵抗性，同时证实放疗可增强对手术后残余病灶的局部控制，更是治疗转移病灶的有效手段。因此，开展有关GIST放疗敏感性相关的基础研究，对于未来优化GIST的治疗策略，提高患者的预后，改善患者的生存质量有重要意义。
研究表明，Ano1和KIT是GIST的特异性标记物。Ano1在GIST的生长发育过程中，起到了调节其增殖分裂的作用。KIT基因的突变，是ICC(InterstitialcellsofCajal，Cajal间质细胞)谱系的细胞向胃肠道间质瘤转化的主要病因。鉴于Ano1和KIT在GIST中起到的重要作用，那么，GIST细胞在接受电离辐射后，Ano1和KIT的表达有没有发生变化？GSIT细胞的增殖活性和凋亡情况又会有怎么样的变化？Ano1和KIT的表达变化与GSIT细胞活性之间有无相关性？这些问题都值得进一步研究。
因此，本研究拟采用CCK8法和流式细胞仪检测电离辐射后GIST细胞增殖活性和凋亡，RT-PCR和WB检测电离辐射后GIST中Ano1和KIT分子的mRNA和蛋白表达，为以后进一步研究GSIT的放疗机制提供研究基础。
第一部分：电离辐射对胃肠道间质瘤细胞增殖和凋亡的影响
目的：探讨胃肠道间质瘤细胞株(GIST-T1)在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，GIST-T1的增殖活性的变化以及有无凋亡的发生。
方法：实验细胞为人胃肠道间质瘤细胞株(GIST-T1)，由北京北纳创联生物技术研究院购入。细胞培养基为CM5-1，成分为89%McCoy’s5A+10%胎牛血清+1%双抗。实验分组：未照射组、2Gy照射组、5Gy照射组、7Gy照射组，观察时间点分别为照射后1d、2d、3d、4d、5d。使用CCK8试剂盒和流式细胞仪分别检测照射后GIST细胞的增殖活性和凋亡。
结果：细胞增殖活性实验结果表明，电离辐射能一定程度的抑制胃肠道间质瘤细胞的增殖。2Gy电离辐射后，细胞增殖抑制率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为3.08、5.96、7.38、9.69、12.40，随着照射后时间延长，抑制增殖的作用缓慢增加，增加幅度较小。5Gy电离辐射后，细胞增殖抑制率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.84、7.66、15.12、29.43、31.17，随着照射后时间延长，抑制增殖的作用逐渐增加，增加幅度明显。7Gy电离辐射后，细胞增殖抑制率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为﹣1.19、10.80、29.06、43.39、52.26随着照射后时间延长，抑制增殖的作用显著增加，增加幅度较大。细胞凋亡实验表明，电离辐射能使GIST细胞出现细胞凋亡的现象。2Gy电离辐射组细胞凋亡率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为6.53±1.25、6.72±2.20、19.63±1.56、12.40±0.74、18.57±1.04，随着照射后时间延长，GIST细胞逐渐出现细胞凋亡。5Gy电离辐射组细胞凋亡率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为5.59±0.80、11.08±1.43、18.09±2.26、22.63±2.06、25.79±2.56。7Gy电离辐射组细胞凋亡率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为6.20±2.23、12.76±1.76、21.24±1.14、24.87±1.60、31.92±0.74。5Gy、7Gy电离辐射组随着照射后时间延长，GIST细胞逐渐出现凋亡并且凋亡率逐渐升高。GIST细胞在照射后1d未出现细胞凋亡；在照射后2d，2Gy照射组仍然未出现细胞凋亡，但是5Gy照射组和7Gy照射组出现了细胞凋亡，且凋亡率相近。在照射后3d，所有照射组均出现了细胞凋亡，且凋亡率相差较小。在照射后4d和5d，随着照射剂量增加细胞凋亡率逐渐升高。
第二部分：电离辐射对胃肠道间质瘤Ano1蛋白和KIT蛋白表达的影响
目的：探讨胃肠道间质瘤细胞株(GIST-T1)在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，GIST-T1的Ano1蛋白和KIT蛋白表达的变化。
方法：实验细胞为人胃肠道间质瘤细胞GIST-T1，由北京北纳创联生物技术研究院购入。细胞培养基为CM5-1，成分为89%McCoy’s5A+10%胎牛血清+1%双抗。细胞接种于六孔板中，每24-48h换液，待细胞密度约为80-90%时，对GIST进行电离辐射。实验分组：未照射组、2Gy照射组、5Gy照射组、7Gy照射组，观察时间点分别为照射后1d、2d、3d、4d、5d。利用RT-PCR和WB技术检测Ano1mRNA、Ano1蛋白和KIT蛋白表达的变化。
结果：在Ano1的mRNA表达水平上，表达随时间呈现先下降然后逐渐回升的趋势。2Gy照射组表达量在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.782±0.037、0.523±0.028、0.589±0.049、0.956±0.100、0.932±0.047。Ano1的表达在照射后1d开始降低，2d达到最低点，而在3d逐渐恢复，4d恢复至正常水平；5Gy照射组表达量在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.180±0.025、0.416±0.019、0.481±0.030、0.912±0.106、0.008±0.086。Ano1的表达在照射后1d达到最低点，2d开始逐渐恢复，4d恢复至正常水平；7Gy照射组表达量在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.193±0.242、0.209±0.022、0.327±0.035、0.550±0.070、0.929±0.460。Ano1表达明显下降，3d开始逐渐恢复，4d仍低于未照射组，5d恢复至正常水平。Ano1蛋白表达的水平上，表达随时间呈现出先降低，然后逐渐恢复的趋势。2Gy照射组表达量(Ano1/GAPDH)在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.680±0.028、0.571±0.019、0.533±0.035、0.622±0.023、0.658±0.024。给予2Gy照射后3dAno1的表达达到最低点，而在4d增加，5d逐渐恢复。5Gy照射组表达量(Ano1/GAPDH)在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.938±0.032、0.869±0.009、0.856±0.022、0.898±0.012、0.927±0.022。接受5Gy照射后3dAno1的表达水平达到最低点，从4d开始逐渐增多。7Gy照射组表达量(Ano1/GAPDH)在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为1.025±0.053、0.842±0.017、0.894±0.044、0.901±0.019、0.996±0.068。进行7Gy照射后，Ano1表达水平明显下降，在照射后2d达到最低点，而且其表达恢复趋势较缓慢，3d开始恢复，5d仍低于未照射组。KIT蛋白的表达水平上，2Gy照射组表达量(KIT/GAPDH)在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为1.055±0.072、1.094±0.078、1.122±0.030、1.090±0.075、1.115±0.097，与对照组相比无统计学意义。7Gy照射组表达量在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为1.041±0.049、1.009±0.043、1.030±0.065、1.013±0.066、0.986±0.037，与对照组相比无统计学意义。KIT蛋白的表达量随着剂量增加和时间推移未发生变化。
全文结论
1.GIST细胞在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，生长受到一定程度的抑制，且有凋亡表现，细胞增殖活性的抑制程度和细胞凋亡率与照射剂量和照射后时间呈依赖关系。
2.GIST细胞在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，Ano1蛋白的表达出现了先下降、后回升的变化。随着照射剂量增加，Ano1表达下降的程度越大、到达谷值时间越短，且Ano1的表达恢复速度越慢。
3.GIST细胞在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，KIT蛋白无明显变化。提示KIT蛋白可能不是GSIT放疗敏感靶点。
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromaltumor，GIST)是胃肠道最常见的间质肿瘤，占所有胃肠道间质肿瘤的80％，占所有胃肠道恶性肿瘤的0.1％至3％。传统观念认为，胃肠道间质瘤属于肉瘤范畴，对放疗不敏感。但近年来，国内外已有越来越多的案例报道表明，GIST并非普遍具有放射抵抗性，同时证实放疗可增强对手术后残余病灶的局部控制，更是治疗转移病灶的有效手段。因此，开展有关GIST放疗敏感性相关的基础研究，对于未来优化GIST的治疗策略，提高患者的预后，改善患者的生存质量有重要意义。
研究表明，Ano1和KIT是GIST的特异性标记物。Ano1在GIST的生长发育过程中，起到了调节其增殖分裂的作用。KIT基因的突变，是ICC(InterstitialcellsofCajal，Cajal间质细胞)谱系的细胞向胃肠道间质瘤转化的主要病因。鉴于Ano1和KIT在GIST中起到的重要作用，那么，GIST细胞在接受电离辐射后，Ano1和KIT的表达有没有发生变化？GSIT细胞的增殖活性和凋亡情况又会有怎么样的变化？Ano1和KIT的表达变化与GSIT细胞活性之间有无相关性？这些问题都值得进一步研究。
因此，本研究拟采用CCK8法和流式细胞仪检测电离辐射后GIST细胞增殖活性和凋亡，RT-PCR和WB检测电离辐射后GIST中Ano1和KIT分子的mRNA和蛋白表达，为以后进一步研究GSIT的放疗机制提供研究基础。
第一部分：电离辐射对胃肠道间质瘤细胞增殖和凋亡的影响
目的：探讨胃肠道间质瘤细胞株(GIST-T1)在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，GIST-T1的增殖活性的变化以及有无凋亡的发生。
方法：实验细胞为人胃肠道间质瘤细胞株(GIST-T1)，由北京北纳创联生物技术研究院购入。细胞培养基为CM5-1，成分为89%McCoy’s5A+10%胎牛血清+1%双抗。实验分组：未照射组、2Gy照射组、5Gy照射组、7Gy照射组，观察时间点分别为照射后1d、2d、3d、4d、5d。使用CCK8试剂盒和流式细胞仪分别检测照射后GIST细胞的增殖活性和凋亡。
结果：细胞增殖活性实验结果表明，电离辐射能一定程度的抑制胃肠道间质瘤细胞的增殖。2Gy电离辐射后，细胞增殖抑制率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为3.08、5.96、7.38、9.69、12.40，随着照射后时间延长，抑制增殖的作用缓慢增加，增加幅度较小。5Gy电离辐射后，细胞增殖抑制率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.84、7.66、15.12、29.43、31.17，随着照射后时间延长，抑制增殖的作用逐渐增加，增加幅度明显。7Gy电离辐射后，细胞增殖抑制率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为﹣1.19、10.80、29.06、43.39、52.26随着照射后时间延长，抑制增殖的作用显著增加，增加幅度较大。细胞凋亡实验表明，电离辐射能使GIST细胞出现细胞凋亡的现象。2Gy电离辐射组细胞凋亡率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为6.53±1.25、6.72±2.20、19.63±1.56、12.40±0.74、18.57±1.04，随着照射后时间延长，GIST细胞逐渐出现细胞凋亡。5Gy电离辐射组细胞凋亡率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为5.59±0.80、11.08±1.43、18.09±2.26、22.63±2.06、25.79±2.56。7Gy电离辐射组细胞凋亡率在照射后1d、2d、3d、4d、5d分别为6.20±2.23、12.76±1.76、21.24±1.14、24.87±1.60、31.92±0.74。5Gy、7Gy电离辐射组随着照射后时间延长，GIST细胞逐渐出现凋亡并且凋亡率逐渐升高。GIST细胞在照射后1d未出现细胞凋亡；在照射后2d，2Gy照射组仍然未出现细胞凋亡，但是5Gy照射组和7Gy照射组出现了细胞凋亡，且凋亡率相近。在照射后3d，所有照射组均出现了细胞凋亡，且凋亡率相差较小。在照射后4d和5d，随着照射剂量增加细胞凋亡率逐渐升高。
第二部分：电离辐射对胃肠道间质瘤Ano1蛋白和KIT蛋白表达的影响
目的：探讨胃肠道间质瘤细胞株(GIST-T1)在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，GIST-T1的Ano1蛋白和KIT蛋白表达的变化。
方法：实验细胞为人胃肠道间质瘤细胞GIST-T1，由北京北纳创联生物技术研究院购入。细胞培养基为CM5-1，成分为89%McCoy’s5A+10%胎牛血清+1%双抗。细胞接种于六孔板中，每24-48h换液，待细胞密度约为80-90%时，对GIST进行电离辐射。实验分组：未照射组、2Gy照射组、5Gy照射组、7Gy照射组，观察时间点分别为照射后1d、2d、3d、4d、5d。利用RT-PCR和WB技术检测Ano1mRNA、Ano1蛋白和KIT蛋白表达的变化。
结果：在Ano1的mRNA表达水平上，表达随时间呈现先下降然后逐渐回升的趋势。2Gy照射组表达量在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.782±0.037、0.523±0.028、0.589±0.049、0.956±0.100、0.932±0.047。Ano1的表达在照射后1d开始降低，2d达到最低点，而在3d逐渐恢复，4d恢复至正常水平；5Gy照射组表达量在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.180±0.025、0.416±0.019、0.481±0.030、0.912±0.106、0.008±0.086。Ano1的表达在照射后1d达到最低点，2d开始逐渐恢复，4d恢复至正常水平；7Gy照射组表达量在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.193±0.242、0.209±0.022、0.327±0.035、0.550±0.070、0.929±0.460。Ano1表达明显下降，3d开始逐渐恢复，4d仍低于未照射组，5d恢复至正常水平。Ano1蛋白表达的水平上，表达随时间呈现出先降低，然后逐渐恢复的趋势。2Gy照射组表达量(Ano1/GAPDH)在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.680±0.028、0.571±0.019、0.533±0.035、0.622±0.023、0.658±0.024。给予2Gy照射后3dAno1的表达达到最低点，而在4d增加，5d逐渐恢复。5Gy照射组表达量(Ano1/GAPDH)在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为0.938±0.032、0.869±0.009、0.856±0.022、0.898±0.012、0.927±0.022。接受5Gy照射后3dAno1的表达水平达到最低点，从4d开始逐渐增多。7Gy照射组表达量(Ano1/GAPDH)在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为1.025±0.053、0.842±0.017、0.894±0.044、0.901±0.019、0.996±0.068。进行7Gy照射后，Ano1表达水平明显下降，在照射后2d达到最低点，而且其表达恢复趋势较缓慢，3d开始恢复，5d仍低于未照射组。KIT蛋白的表达水平上，2Gy照射组表达量(KIT/GAPDH)在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为1.055±0.072、1.094±0.078、1.122±0.030、1.090±0.075、1.115±0.097，与对照组相比无统计学意义。7Gy照射组表达量在电离辐射后1d、2d、3d、4d、5d分别为1.041±0.049、1.009±0.043、1.030±0.065、1.013±0.066、0.986±0.037，与对照组相比无统计学意义。KIT蛋白的表达量随着剂量增加和时间推移未发生变化。
全文结论
1.GIST细胞在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，生长受到一定程度的抑制，且有凋亡表现，细胞增殖活性的抑制程度和细胞凋亡率与照射剂量和照射后时间呈依赖关系。
2.GIST细胞在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，Ano1蛋白的表达出现了先下降、后回升的变化。随着照射剂量增加，Ano1表达下降的程度越大、到达谷值时间越短，且Ano1的表达恢复速度越慢。
3.GIST细胞在接受不同剂量的电离辐射急性照射后，KIT蛋白无明显变化。提示KIT蛋白可能不是GSIT放疗敏感靶点。