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L-精氨酸是人体的半必须氨基酸,是生物体内尿素循环的中间体,具有重要的生理学意义,因此在食品、医药、饲料等方面有着广泛的应用。而且市场对精氨酸的需求量正在不断的增加。谷氨酸棒杆菌是主要的精氨酸生产菌,其基因组已被测序,各种载体系统丰富,敲除体系已经构建,可进行代谢工程育种。前期的研究发现,谷氨酸棒杆菌ATCC14067原始菌株不积累精氨酸。过表达突变型argBH268E后,可大量积累,但是产量受供氧影响很大,供氧是发酵过程中的关键条件。因此,本文先建立了精氨酸发酵的分析方法,通过不同供氧条件下代谢流量的分布来解释供氧影响谷氨酸棒杆菌工程菌精氨酸合成的机制,确定合适的供氧条件。同时发现在供氧充足的情况下,工程菌会大量积累瓜氨酸。因此,在原始菌株ATCC14067串联表达argBH268E-argGH,强化精氨酸合成途径,进一步提高精氨酸产量,并用代谢流分析串联表达对精氨酸合成的影响。1.建立了发酵液中氨基酸的分析方法,为代谢流分析奠定基础。利用DNFB衍生氨基酸HPLC的方法分析发酵液中的氨基酸,方法为:使用Phenomenex Gemini NX C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,柱温30℃,采用流动相A为0.05mM乙酸钠溶液,流动相B为乙腈-水比1:1(v/v),梯度洗脱,检测波长为360nm。该方法重现性好,灵敏度高。2.探究了不同供氧条件对谷氨酸棒杆菌精氨酸合成的影响。通过不同供氧条件下精氨酸的发酵过程分析发现:高供氧有利于精氨的积累,氧的供应不足会严重抑制L-精氨酸的合成。进一步对不同供氧条件下精氨酸发酵的代谢流分析,供氧提高,TCA流量增强,PEP回补途径增强,α-酮戊二酸节点处流向谷氨酸的流向增强,因此精氨酸产量提高。进行高供氧补料发酵,精氨酸的产量提高了86%。同时在发酵过程中,精氨酸的代谢中间产物瓜氨酸出现了大量积累。3.在谷氨酸棒杆菌中串联表达arg BH268E-argGH加强精氨酸合成途径,提高精氨酸的积累量。首先,构建了串联表达质粒Peftu-argBH268E-argGH,并将其转入到谷氨酸棒杆菌14067中。对过表达菌株14067-Peftu-arg BH268E-arg GH进行补料发酵分析,结果显示,串联表达菌株发酵过程中,精氨酸的积累量达到10.75g/L,比单独表达argBH268E提高了130%。同时,瓜氨酸的积累量明显减少,只有0.37g/L,仅为单独表达的14%。说明串联表达加强了瓜氨酸向精氨酸的转化,提高了精氨酸合成代谢的通量。对补料发酵的代谢流分析,发现串联表达加强了酮戊二酸流向精氨酸合成的流量,减少瓜氨酸积累的流量,同时PEP回补途径也随之加强,弥补了草酰乙酸的不足。因此才使精氨酸的积累得到了极大的提高。