论文部分内容阅读
病毒侵染植物后经常引起植物发育异常。病症通常表现为矮化,叶片失绿,叶片形态发生改变等,严重时甚至引起植物死亡。病毒通过干扰植物激素平衡,扰乱寄主蛋白降解途径,利用寄主RNA silencing系统特异降解寄主mRNA等方式使寄主致病。
植物利用水杨酸(SA)作为信号分子的抗性基因(resistance genes,R-genes)介导的抗性和RNA silencing主动抵抗病毒侵染。在植物中RNA依赖的RNA聚合酶1(RNA-dependent RNA polymerase1,RDR1)受病毒侵染和SA处理诱导,且具有抗病毒的作用；而RDR6则通过参与病毒诱导的基因沉默起到抗病毒的作用。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中,RDR1基因含有一个72碱基的插入导致功能缺失(NbRDR1m)。我们利用和本氏烟NbRDR1m高度同源的普通烟RDR1(NtRDR1)转化N.benthamiana,研究NtRDR1在N.benthamiana中的抗病毒作用,进而探讨NbRDR1m自然失活的生物学意义。
N.benthamiana NtRDR1转基因植物感染嵌合有绿色荧光蛋白(GFP)的Plumpox potyvirus(PPV-GFP)后,表现出对PPV-GFP更加敏感。和野生型植物相比,NtRDR1植物系统叶中累积更多的病毒且病症更重。NtRDR1转基因植物对多种病毒的反应类似RDR6i(RDR6被沉默)植物。Real-time PCR检测发现过表达NtRDR1并不共抑制N.benthamiana中其它RDRs基因表达,并且NtRDR1转基因植物体内SA途径不受影响。利用农杆菌注射诱导GFP沉默的实验发现NtRDR1可以延迟GFP基因沉默。利用瞬时产生artificial trans-acting siRNA(syn-tasiRNAs)诱导GFP沉默体系,结合NtRDR1和RDR6i植物,我们研究了NtRDR1在ta-siRNA介导的基因沉默中的作用。结果显示NtRDR1植物中GFP绿色荧光消退晚于野生型植物,而且植物体内的GFP mRNA累积水平高于野生型植物。在NtRDR1植物中syn-tasiRNAs累积水平和野生型植物类似,而在RDR6i植物中检测不到syn-tasiRNAs。综合上述实验结果,我们得到以下结论:(1)NtRDR1具有基因沉默抑制子活性；(2)NtRDR1抑制sense posttranscriptional gene silencing(S-PTGS)和syn-tasiRNA介导的GFP RNA silencing；(3)NtRDR1不抑制依赖RDR6的siRNAs的产生。northern blot检测植物内源的siRNAs和miRNAs在NtRDR1植物和野生型植物中的累积水平,结果显示在NtRDR1植物中植物内源siRNAs和miRNAs累积水平和野生型植物相近,从而表明NtRDR1不影响植物内源siRNA和miRNA的累积水平。此外测序分析PPV-GFP感染野生型植物和NtRDR1植物体内产生病毒来源的siRNAs(vsiRNAs)5’第一个碱基占同一长度vsiRNAs的比例,发现NtRDR1植物来源的vsiRNAs的5’首个碱基出现的频率没有发生明显改变。推测NtRDR1基因沉默抑制子活性可能作用在siRNA产生下游。结合在NahG(水杨酸水解酶)转化N.benthamiana植物中PPV-GFP累积量和野生型植物相近的现象,我们推测N.benthamiana在和病毒长期共进化过程中,在高选择压力下通过牺牲微弱的SA介导的抗性来加强RDR6介导的对病毒的抗性。
我们首次报道植物中的RDR具有基因沉默抑制子活性,丰富了RDR在植物体内功能的认识。NtRDR1产生的次级siRNAs和它们的功能还有待深入研究。本论文除了分析NtRDR1在植物对病毒反应中的作用外,还对SA在病毒诱导的基因沉默中的作用做了初步探讨。