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食管癌(Carcinomaofesophageal)是恶性程度高的消化系肿瘤,其发病率近几年来在国内外均有逐年上升趋势。95%的食管癌患者为鳞状细胞癌。由于食管癌在临床上缺乏特异表现,恶性程度高,极易出现转移。目前食管癌早期临床诊断仍缺乏有效的方法,患者确诊时大多已发生转移,丧失手术时机。患者的预后目前传统治疗手段均未能显著改善,因此食管癌的治疗新途径需通过食管癌发生、发展的分子生物学机制寻找。
表观遗传学(Epigenetics)是指在基因DNA序列没有发生改变的情况下,基因功能发生了可遗传的变化,并最终导致了表型变化。细胞的增殖分化是通过DNA甲基化和组蛋白修饰调控细胞在适当的空间和时间位置表达适当的基因。在哺乳动物细胞中,乙酰化和去乙酰化的平衡在基因转录和不同细胞蛋白功能中起到关键的作用。组蛋白乙酰转移酶(HistoneAcetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HistoneDeacetylases,HDACs)调节组蛋白乙酰化状态,控制着染色质的结构和基因的表达,它们的功能紊乱是肿瘤发生发展的重要分子机制之一。
HDACs共有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四类。Ⅰ类HDACs包括HDAC1、2、3、8;HDACs在基因阻遏、调节细胞周期和分化、染色质重塑中起到重要作用。肿瘤细胞中HDACs功能异常可导致许多基因转录抑制,抑制抑癌基因表达。HDACs抑制剂通常针对Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类HDAC为靶点,目前己在临床试验中进行评估。
有研究表明在早期大肠癌的息肉阶段HDAC2的上调比HDAC1更高。在宫颈不典型增生和浸润癌在异型增生过渡区,HDAC2的表达比HDAC1明显高染色。在胃癌,肠癌和前列腺癌中HDAC2与HDAC1和3的表达是与疾病的晚期和预后不良相关。大样本的胃癌,前列腺癌和大肠癌研究中,HDAC3和HDAC1,2的表达与预后不良显着相关。Ⅰ类HDACs被许多学者认为是癌症治疗最相关的目标,因为抑制剂具有抗HDAC1、2、3的活性,通常显示出强抗增殖和诱导凋亡的活性。HDAC1过表达在胃肠系统癌症尤为常见,是与去分化提高增殖,侵袭,疾病进展和不良预后有关。然而这些研究大多是对HDAC1,所以我们认为HDAC2,3在肿瘤的发生和发展中可能起到重要作用。
截止目前HDAC2、3在食管鳞癌中的表达及其在食管鳞癌的发生发展中的作用研究尚无报道。因此有必要利用分子生物学的方法对HDAC2、3基因在食管鳞癌组织中表达水平进行检测,了解其在食管鳞癌发病机制中的作用,并分析与患者临床和病理特性的相关性,以寻找治疗食管癌的新途径,为食管癌的基因治疗提供候选靶点。
本研究包括三部分内容,分述如下。
一、HDAC2、3mRNA在人食管鳞癌组织中表达的研究
目的:检测组蛋白去乙酰化酶2、3在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达情况,探讨组蛋白去乙酰化酶2、3在食管鳞癌中的作用。
方法:收集30例手术切除的食管鳞癌组织及相应的癌旁组织和5例正常食管组织,采用real-timeRT-PCR法(SYBRGREEN法)检测上述来源组织中HDAC2、3基因mRNA的表达情况。
结果:以正常食管组织为对照,30例食管鳞癌组织和癌旁组织中HDAC2mRNA表达量(5.45±2.58)明显高于癌旁组织组(3.98±2.98),两组间差异有统计学意义(t=4.541,P＜0.01);HDAC3mRNA水平上明显高于癌旁组织组(4.97±3.88vs2.18±2.04),两组间差异有统计学意义(t=4.443,P＜0.01)。
结论:食管鳞癌组织中HDAC2mRNA和HDAC3mRNA的表达明显高于癌旁组织,表明HDAC2、3基因的异常激活可能在食管鳞癌的发生、发展中起到重要的作用。
二、HDAC2、3蛋白在人食管鳞癌组织中表达的研究
目的:检测组蛋白去乙酰化酶2、3在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达情况,探讨组蛋白去乙酰化酶2、3在食管鳞癌中的作用。
方法:收集30例手术切除的食管鳞癌组织及相应的癌旁组织和5例正常食管组织,采用Westernblot方法检测上述来源组织中HDAC2、3蛋白的表达情况。
结果:HDAC2在癌组织中蛋白的表达明显高于癌旁组织及5例正常组织。不同分化组癌组织HDAC2表达量均高于癌旁组织,高分化(0.86±0.05vs0.39±0.08,P＜0.01),中分化(1.35±0.10vs1.02±0.13,P＜0.01),低分化(1.51±0.09vs0.53±0.05,P＜0.01);HDAC3在癌组织中蛋白的表达明显高于癌旁组织及5例正常组织。不同分化组癌组织HDAC3表达量均高于癌旁组织,高分化(0.74±0.06vs0.35±0.10,P＜0.01),中分化(1.24±0.09vs0.89±0.10,P＜0.01),低分化(1.46±0.08vs0.49±0.04,P＜0.01)。
结论:食管鳞癌组织中HDAC2和HDAC3蛋白的表达明显高于癌旁组织,表明HDAC2、3基因的异常激活与食管鳞癌的发生发展有关。
三、人食管鳞癌组织中HDAC2和HDAC3的表达与临床表现和病理的相关性研究
目的:检测HDAC2和HDAC3蛋白在人食管鳞癌组织中的表达情况,分析食管鳞癌组织中HDAC2和HDAC3蛋白表达水平与临床表现和病理的相关性。
方法:收集2007年10月-2010年10月江苏大学附属医院手术切除的90例食管鳞癌患者的食管鳞癌组织,同时收集患者临床资料。所有病例均经病理确诊为食管鳞状细胞癌。采用链霉素抗生物素-过氧化酶(streptavidinperoxidase,SP)免疫组织化学法检测食管鳞癌组织中HDAC2和HDAC3蛋白表达。根据核染色强度和核阳性细胞百分比进行判断,强度:0(无染色),1(弱染色),2(中度染色),3(强染色);核阳性细胞百分比:0(无),1(＜10%),2(10-50%),3(51-80%),4(＞80%)。染色指数范围从0到12(核染色强度和核阳性细胞百分比相乘)(0-6低表达,8-12高表达)。
结果:HDAC2和HDAC3在食管鳞癌细胞癌细胞核染色,阳性细胞为棕黄色。在非肿瘤细胞中偶见阳性细胞。HDAC2阳性表达率79%(71/90),HDAC3阳性表达率为70%(63/90)。分析HDAC2和HDAC3蛋白表达强度与临床病理参数的关系,HDAC2和HDAC3表达强度与TNM分期和淋巴结转移相关(P＜0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、病理学大体分型、浸润深度及分化程度无关(P＞0.05)。HDAC2和HDAC3在食管鳞癌组织中的表达呈正相关(r=0.790,P＜0.01)。
结论:在食管鳞癌组织中HDAC2和HDAC3高表达在食管鳞癌的侵袭力及淋巴结转移中起到重要的作用。
通过上述研究,本课题得出以下结论:
1、食管鳞癌组织中HDAC2和HDAC3mRNA较食管鳞癌癌旁组织表达高。
2、HDAC2和HDAC3蛋白在食管鳞癌组织表达明显高于癌旁组织,食管鳞癌组织中HDAC2和HDAC3高表达与食管鳞癌的侵袭力及淋巴结转移有密切关系。
3、HDAC2与HDAC3在食管鳞癌组织中的表达呈正相关。
因此HDAC2和HDAC3可能成为食管鳞癌基因治疗的一个潜在治疗靶点及预后预测指标,有关于其他HDACs家族成员的功能和治疗研究需要在今后的研究中进一步深入。