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水貂细小病毒(Mink enteritis virus,MEV)是一种急性烈性传染病的病原,可以引起水貂急性肠炎和白细胞减少,造成剧烈腹泻,给水貂养殖业造成巨大损失。对该病的预防及控制方法主要依靠接种弱毒苗或组织灭活苗,灭活苗的大规模应用以及MEV的易变异都给该病的诊断和预防带来了很大困难。本研究利用噬菌体展示技术对MEV的抗原表位进行了筛选,对科学合理地设计表位疫苗和开发鉴别诊断试剂提供了物质材料,本研究对水貂病毒性肠炎的防控具有重要意义。本研究获得如下结果: 1、本研究将MEV接种水貂后收取粪便毒MEV-8Y2,蔗糖密度梯度离心纯化后在电镜下观察到了MEV病毒粒子,电镜图片显示装配完成和未完成两种病毒粒子形态,对纯化后的病毒粒子进行血凝试验,效价为215。 2、利用纯化的水貂细小病毒MEV-8Y2免疫小鼠,制备了三株单克隆抗体,分别命名为G2a-C9、M-C1、M-A5,经生物学鉴定之后得到,单克隆抗体 G2a-C9亚类为 IgG2a,血凝抑制效价为210,ELISA效价为1:2×105,活性较高,可用于抗原表位的研究及其他诊断试剂的研制。 3、根据GenBank上提供的NS1与VP2基因序列,本研究设计了两对针对NS1及VP2基因全长的引物,并将NS1与VP2基因进行了克隆和原核表达,最终得到NS1长度为2007bp、VP2长度为1755bp的基因片段,表达NS1重组蛋白大小为100kDa左右,VP2重组蛋白为85kDa左右,且经Western blot分析具有良好的抗原性。 4、结合上述制得的水貂细小病毒单克隆抗体G2a-C9与原核表达的NS1和VP2重组蛋白进行了反应性检测,本研究利用Western blot进行分析,结果为重组VP2蛋白可以与单克隆抗体G2a-C9有很好的反应性,因此推测单抗G2a-C9所针对的MEV抗原表位位于VP2蛋白上。 5、为了进一步预测单抗G2a-C9所针对的MEV抗原表位为线性模拟表位还是构象模拟表位,本研究将VP2基因分6段进行了真核瞬时表达,经间接免疫荧光检测与单抗反应性,推测抗原表位可能位于VP2基因855-1228bp之间,推测为线性模拟表位。 6、在上述预测结果的基础上,本研究利用噬菌体展示技术对水貂细小病毒抗原表位进一步筛选,得到一段序列为LGLG(--)N的7肽片段,与VP2氨基酸序列比对发现,该序列与VP2蛋白的285-302氨基酸序列高度同源,所以推测该序列为VP2蛋白上的线性模拟表位。