利用酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内RSV-GN互作蛋白因子

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ruinx
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由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病给我国水稻生产造成了巨大的损失。该病毒由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)传播,能够在介体内循回增殖,并经卵传播给后代。目前,灰飞虱的传毒机制仍然不清楚,而对该问题的研究,是控制其传播病毒的关键。本实验室先前研究发现,来自于NSvc2的RSV-GN和GC很可能在灰飞虱传播RSV的过程中起到重要的作用。本论文以RSV-GN作为诱饵蛋白筛选灰飞虱酵母双杂交cDNA文库,以期能够筛选到介体体内与GN互作的关键蛋白因子。  构建诱饵蛋白酵母双杂交载体pGBKT7-GN,并将其转入酵母菌AH109中,通过其在营养缺陷型培养基上的生长情况,确定该诱饵蛋白对酵母菌无毒性,同时也不具有自激活活性。大量制备含pGBKT7-G-N载体的AH109酵母感受态细胞,采用顺序转化法,转入文库质粒,测得转化效率为4.12×104cfu/μg。将转化产物涂布于SD/-His-Leu-Trp平板,挑取生长状况良好的菌落至含X-a-gal的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上。挑取生长良好且变蓝色的酵母菌落,摇菌提取质粒,PCR扩增检测插入片段的大小,并将插入片段大于500bp的酵母质粒转化大肠杆菌,测序分析。共计检测192个候选克隆,将含有正确读码框质粒的酵母菌称为阳性克隆。将测序结果于Genbank数据库中Blast比对,确定插入片段的基因属性。最后证实这些阳性克隆属于24个不同的基因,其中至少有8个基因的ORF是完整的。在获得的互作因子中,有3个表皮蛋白(膜蛋白),它们有可能是GN受体的候选蛋白,这是一个引人关注发现,在后续实验中需要重点研究。  此外,为给分析灰飞虱获毒过程提供便利的方法,本论文比较了3种灰飞虱饲毒(RSV)方法,即薄膜饲毒、离体病叶饲毒及病株饲毒。结果显示,薄膜饲毒方法并不能使灰飞虱获毒,离体病叶饲毒和病株饲毒均可使无毒灰飞虱获毒,且获毒率基本一致。并以新鲜离体病叶饲毒方法鉴定了一个灰飞虱高获毒率(18.75%)品系Q14,为后续研究灰飞虱获毒机制提供了可靠的方法和材料。
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