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维甲酸(retinoic acid，RA)是维生素A的代谢产物，生理剂量的RA可有效的调节胚胎发育诸多过程，然而，过量的RA导致腭裂发生的机制至今还不明确。在实验研究中常用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，atRA)代替RA。转化生长因子β(transforming growth factor-βs，TGF-βs)是参与腭突发育的一类至关重要的细胞因子。TGF-βs通过激活Smad依赖的信号通路或者非Smad依赖的信号通路而发挥作用。目前研究较多的是TGF-β/Smad信号通路。在生物体的许多系统中，RA可以调控TGF-βs在其中的表达。然而，不仅RA对TGF-βs途径有调节作用，TGF-βs对RA途径也有调节作用，二者协调平衡是维持胚胎正常发育的关键机制之一。 本研究通过胎鼠腭突间充质细胞体外培养和腭裂动物模型的建立，从体内外探索了RA和TGF-β/Smad途径在腭裂诱发中的相互作用及机制，从而为腭裂预防和发病机制的研究提供依据。 目的： 1建立胎鼠腭突间充质细胞体外培养体系和腭裂动物模型，观察体内外atRA和TGF-β3对腭突间充质细胞增殖的影响。 2通过检测RA和TGF-β/Smad信号途径下游关键信号分子蛋白的表达，探索RA和TGF-β/Smad信号途径在腭突间充质细胞增殖过程中的交互作用。 3通过分析胎鼠腭突间充质细胞内TG-相互作用因子(TG-interacting factor，TGIF)与RARβ或者Smad2的结合情况，探索TGIF对RA和TGF-β/Smad信号途径交互作用的调节及其机制。 4探索胎鼠腭突发育关键时期atRA对TGF-β3基因启动子区DNA甲基化以及TGF-β3蛋白和mRNA表达的影响，以进一步明确RA诱发腭裂的机制。 方法： 1实验动物 成年健康SPF级C57BL/6N近交系小鼠按雌雄比例3∶1于当日晚8:00合笼交配，并于次日晨8:00检查雌鼠阴栓，查到阴栓者记录为妊娠天数(gestation day，GD)0。体外实验的研究对象为GD13胎鼠。体内实验的研究对象为GD13、GD14和GD15胎鼠。 2方法 2.1体外实验 2.1.1GD13胎鼠腭突间充质细胞分离、培养及鉴定。 2.1.2MTT实验检测不同浓度的atRA在不同时间点对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响。 2.1.3MTT实验检测atRA和TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响。 2.1.4Western Blot检测atRA对RA和TGF-β信号途径的关键信号分子(RARβ、Smad2、p-Smad2、Smad4、Smad7)以及TGIF蛋白表达的影响。 2.1.5免疫共沉淀检测atRA和TGF-β3对TGIF与Smad2或者RARβ蛋白结合的影响。 2.1.6MTT检测TGIF基因沉默或者过表达前后atRA和TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响。 2.1.7Western blot来检测TGIF基因沉默或者过表达后，atRA和TGF-β3对彼此下游信号分子(RARβ、Smad2、p-Smad2、Smad7)蛋白表达的影响。 2.2体内实验 2.2.1将孕鼠随机分为实验组和对照组，每组孕鼠28只。实验组孕鼠在GD10上午10时左右，以atRA100mg/kg的剂量进行一次性灌胃。对照组孕鼠以等体积玉米油灌胃。 2.2.2HE染色，观察GD13、GD14和GD15胎鼠腭发育以及atRA诱发腭裂的动态过程。 2.2.3BrdU免疫组织化学检测atRA对GD13、GD14和GD15胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响。 2.2.4采用Sequenom Mas sARRAY(@)Methylation方法，并利用专用的分析软件MassArray EpiTYPER检测atRA对GD14胎鼠腭突间充质细胞内TGF-β3基因启动子区CpG位点甲基化的影响。 2.2.5Real-time PCR检测atRA对GD14胎鼠腭突间充质细胞内TGF-β3基因mRNA表达水平的影响。 2.2.6Western Blot检测atRA对GD14胎鼠腭突间充质细胞内TGF-β3、Smad2、p-Smad2、Smad4、Smad7以及TGIF蛋白表达水平的影响。 2.2.7免疫共沉淀检测atRA对GD14胎鼠腭突间充质细胞内TGIF与Smad2或者RARβ蛋白结合的影响。 3统计学分析 用SPSS17.0软件进行统计学处理，数据用均数±标准差((x)±s)表示，两组间均值比较采用独立样本t-检验，重复测量采用重复测量数据方差分析，多组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，检验水准α=0.05。 结果： 1.体外实验结果 1.1分离、培养并鉴定原代胎鼠腭突间充质细胞。 1.2.不同浓度的atRA在不同时间点对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响MTT实验结果显示:atRA对腭突间充质细胞的生长具有抑制作用，且呈时间-剂量依赖性。 1.3.atRA和TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响及其分子机制 1.3.1体外MTT结果显示:TGF-β3可明显的促进腭突间充质细胞增殖(P＜0.05)，且可明显改善atRA对腭突间充质细胞增殖的抑制作用(P＜0.05)。 1.3.2Western Blot结果显示:atRA可明显抑制TGF-β/Smad信号途径的激活(P＜0.05);外源性TGF-β3也可明显抑制RA信号途径(P＜0.05)。 1.4TGIF在atRA和TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞增殖交互抑制过程中的作用及其机制。 1.4.1Western Blot结果所示:与对照组相比，atRA处理组、TGF-β3处理组以及二者联合处理组腭突间充质细胞内TGIF蛋白的表达明显升高(P＜0.05)。 1.4.2免疫共沉淀结果显示:Smad2和RARβ蛋白均可与TGIF结合;与对照组相比，atRA可以促进TGIF与Smad2蛋白的结合(P＜0.05)，抑制TGIF与RARβ蛋白结合(P＜0.05);然而，TGF-β3可明显抑制TGIF与Smad2蛋白结合(P＜0.05)，促进TGIF与RRβ蛋白的结合(P＜0.05)。 1.4.3利用TGIF siRNA转染的腭突间充质细胞，继续培养72h后，MTT结果显示:与对照组相比，atRA对间充质细胞增殖的抑制作用明显减弱(P＜0.05)，外源性TGF-β3以及atRA和TGF-β3联合作用对间充质细胞增殖的影响变化不大(P＞0.05)。Western Blot结果显示:与对照组相比，TGIF基因敲除后，atRA失去了对TGF-β3/Smad途径抑制作用(P＞0.05);TGF-β3失去了对atRA信号途径的抑制作用(P＞0.05)。 1.4.4利用TGIF表达质粒转染的腭突间充质细胞，继续培养72h后，MTT结果显示:与对照组相比，转染组atRA、TGF-β3以及二者的联合作用对间充质细胞增殖的影响是无明显改变(P＞0.05)。Western Blot结果显示:atRA和TGF-β3对彼此下游信号分子蛋白表达的影响与未转染时几乎一致。 2.动物实验结果 2.1腭裂动物模型显示:对照组胎鼠腭突发育正常，双侧腭突完全融合。实验组的胎鼠腭突发育瘦小，以至于两侧腭突不能在中线处接触融合。 2.2BrdU免疫组织化学染色结果显示:与对照组相比，实验组GD13、GD14和GD15胎鼠腭突间充质细胞BrdU阳性细胞的阳性率显著降低(P＜0.05)。而且，在这三个时间点中，在GD14时细胞增殖的变化最为明显(P＜0.05)。 2.3TGF-β3基因启动子区甲基化检测结果显示:在所有检测位点中，只有检测片段1中的CpG-9和CpG-14位点发生明显的去甲基化改变(P＜0.05)，其它位点的甲基化水平的差异不具有显著性(P＞0.05)。 2.4Real-time PCR结果显示，实验组GD14胎鼠腭突间充质细胞内TGF-β3基因mRNA的表达明显低于对照组（P＜0.05）。 2.5Western Blot结果显示，与对照组相比，实验组GD14胎鼠腭突间充质细胞内Smad2蛋白的表达无明显改变(P＞0.05);然而，p-Smad2和Smad4的蛋白表达明显降低，TGF-β3、Smad7和TGIF蛋白表达明显升高(P＜0.05)。 2.6免疫共沉淀结果显示:在GD14胎鼠腭突间充质细胞内，Smad2和RARβ蛋白均可与TGIF结合;与对照组相比，实验组中TGIF与RARβ蛋白结合明显减少，与Smad2蛋白的结合明显增多(P＜0.05)。 结论： 1atRA对于腭突间充质细胞增殖的抑制作用，可能是导致腭裂畸形的关键。 2atRA诱导腭裂发生的过程中，可能主要通过TGIF来调节对Smad信号途径抑制作用。 3atRA诱导腭裂的发生，可能跟TGF-β3启动子区域特殊位点的甲基化水平降低有关系。 4.体内TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响有可能不是通过激活Smad依赖的信号通路而起作用的。