论文部分内容阅读
一、研究背景和目的:
近20年来,登革热(DF)和登革出血热(DHF)/登革休克综合征(DSS)是最重要的节肢动物传播的病毒性疾病。许多国家发现存在登革病毒(DV)重要的传播媒介白蚊伊蚊,且主要集中在大都市。据估计全世界每年有1亿登革热病例,世界卫生组织统计的登革出血热病例约25万,但实际可能远高于此。目前登革病毒感染引起的疾病主要流行于亚洲、非洲、美洲和太平洋岛屿的一些热带地区[1-3]。
登革病毒属黄病毒属,为单股正链RNA病毒,包括4种密切相关但抗原性不同的血清型(DV-1、2、3、4)。4种血清型的登革病毒可分别感染,但感染后产生的抗体不能保护感染者不再被其它血清型的病毒感染,反而能通过调理作用增强第二种血清型的感染,即抗体依赖的增强感染现象,这可能是引起DHE/DSS的原因。由于4种血清型在热带地区传播流行,因此每个个体均可能同时暴露于4种血清型,这大大增加了DHF/DSS暴发流行的可能性。但目前缺乏有效的抗病毒制剂,而且抗病毒药只在病程早期发挥作用,一旦发病超过48h,其作用将很有限。中医药在辩证治疗病毒性疾病方面积累了大量经验,岭南独特的气候、地理环境以及人的体质类型使岭南地区的疾病谱及证治都具有与其它地区不同的特点,形成独具特色的岭南温病学说。上世纪50年代运用温病治法治疗流行性乙脑获得巨大成功,2003年运用中西结合治疗突发SARS冠状病毒感染也颇有成效,审因论治、辨证治疗突发的急性病毒感染性疾病显示出一定优势[4]。
本研究选择登革2型病毒(Dengue2virus,DEN2)GZ14株进行湿热复合模型的建立及清热祛湿药对其治疗作用的初步研究。利用RT-QPCR技术检测肝、脑、肺、脾等组织和血液中的病毒,组织切片技术确定了DV感染所致的肝脏损伤。通过喂养高脂饲料、将小鼠置于人工气候模拟舱及灌注大肠杆菌建立小鼠的湿热证小鼠模型。复合登革病毒感染、湿热因素建立了登革病毒感染的小鼠湿热复合模型。通过给建立好的模型小鼠灌注清热祛湿药,观察药物对登革病毒感染的湿热小鼠的治疗作用。
二、研究方法:
1、建立单纯的登革病毒小鼠模型,通过观察小鼠不同天数的体重变化、检测血清、肝、脑、肺、脾组织中的病毒及组织切片观察病变,确定小鼠已被感染。
2、通过检测血脂水平及肛温、体重测定,结合小鼠的外在症状表现,建立单纯的湿热小鼠模型。
3、登革病毒感染的湿热小鼠模型的建立及观察清热祛湿药对其治疗作用。免疫组化检测肝、脑组织中核因子-KB(NT-KB)、脑组织中水通道蛋白-4(AQP-4)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)及葡萄糖转运蛋白-1(Glut-1)表达水平。用平均光密度代表阳性表达的强弱,SPSS11.5软件对数据进行处理,不同处理组之间差异采用ONE-WAYANOVA分析。
4、病理组织切片检测肝、脑组织损伤。
三、研究结果:
1、以DEN2GZ14株小鼠血清、肝、脑、肺、脾中提取的RNA为模板,利用Random6mers和OligodT为引物进行反转录,再以cDNA为模板,DENF-Primer、DENR-Primer为引物进行QPCR,均有S型扩增曲线。QPCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳,发现有约100bpDNA片段,分子量大小与预计相符。
2、单纯的DV感染小鼠HE组织切片显示肝脏有较为明显的病变,肺、脑组织较为正常。
3、免疫组化结果显示,对于NF-KB、AQP4、MMP9、GLUT1,单纯DV感染组、DV感染+外湿热组、DV感染+内湿热组及DV感染+内湿热组与正常组比较,P<0.001,差异有显著性意义。肝、脑组织中这些物质的表达水平有不同程度上调。说明肝、脑组织中均存在炎症反应。中药1组(蒿芩清胆汤组)、中药2组(银翘散去牛蒡子、元参+杏仁、滑石方组)与正常组相比较,差异无统计学意义。说明药物能下调这些物质的表达。模型组与其余组相比较:差异有显著性意义,模型组肝组织中NF-KB、AQP4、MMP9、GLUT1平均光密度表达水平最高,说明该组小鼠炎症损害最严重。同一处理因素各组肝、脑组织NF-KB平均光密度表达水平无显著性意义,说明生理病理情况下,NF-KB在肝、脑内同等表达。
4、鼠肝、脑病理切片显示,模型组肝、脑组织损伤最严重,其次为DV感染+内(或外)湿热组,2组损伤大致一样,而单纯DV感染组及中药干预组则接近正常。
四、结论:
建立了登革病毒感染的湿热小鼠模型。
清热祛湿药对登革病毒感染的复合湿热小鼠模型具有一定的治疗作用。这说明湿热病邪的参与,特别是内外湿热合邪相引导致了DV脑损伤。早期清热利湿法的干预:银翘散加减方和蒿芩清胆汤都能起到抗脑损伤的作用,其通过清利一方湿热之邪为主,使其不能内外相引,则另一方湿热之邪也易除去。