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猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,又名奥耶斯基氏病（Aujezsky’s disease）,是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引发的一种急性病毒性传染病,猪作为PR的自然宿主,同时也是非常重要的贮藏宿主和排毒者,给养猪业带来了巨大的经济损失。PRV是疱疹病毒科（Herpesviridae）的成员之一,不同年龄阶段的猪感染PRV呈现出不同的症状,仔猪一般为致命性脑炎,育肥猪则出现呼吸紊乱,而妊娠母猪将造成流产、死产、产木乃伊胎,成年猪感染后呈隐性感染、长期带毒排毒。在我国PR清除计划中,gE基因缺失的弱毒疫苗已被广泛使用,但仅靠使用疫苗并没有从根本上解决问题。建立一种能有效辨别野毒感染猪与疫苗免疫猪,且同时能够监测疫苗免疫猪IgG的双重高效鉴别诊断技术是最终根除伪狂犬病的关键之一。针对目前PR现状,本研究旨在建立检测速度快、特异性强、敏感度高的gE和gB IgG抗体荧光微球免疫学检测方法（Fluorescent-microbead immunoassay,FMIA）,并在此基础上整合单一检测方法建立高效的双重检测方法,用于PRV野毒感染和疫苗免疫猪IgG的快速鉴别诊断及检测。本研究首先应用pMAL-c5x原核表达体系,构建了PRV gE、gB重组质粒,获得了PRV gE、gB融合MBP和His标签的重组蛋白,经Ni2+柱亲和层析后,进行SDS-PAGE与WB分析。获得具有良好免疫原性与抗原性的重组蛋白,为进一步的间接ELISA方法、FMIA方法的建立奠定了基础。本研究以PRV gE、gB重组蛋白作为包被抗原,经过对ELISA影响各因素的优化,建立了gE、gB IgG抗体的间接ELISA检测方法。该方法经受试者工作特征（R-eceiver operating characteristic,ROC）曲线分析显示,gE的临界值为0.399时,曲线下面积（Area under the ROC,AUC）最大为0.970,敏感度为95.83%,特异性为91.37%;gB的临界值为0.324时,AUC最大为0.928,敏感度为91.67%,特异性为88.89%,表明所建立的ELISA方法对于PRV的检测具有诊断价值。本研究将PRV gE、gB重组蛋白作为抗原分别与12号、28号磁珠微球偶联,用gE-12、gB-28偶联复合体作为捕获载体,分别建立了gE、gB IgG抗体FMIA检测方法。两种方法特异性良好,偶联抗原与其它常见猪病病毒阳性血清没有交叉反应。检测结果经ROC曲线分析显示,gE临界值为5991.5时,AUC最大为0.981,敏感度为92.3%,特异性为99.26%;gB临界值为2862时,AUC最大为0.989,敏感度为96.3%,特异性为95.74%。两种FMIA的ACU均大于ELISA（gE 0.981>0.970;gB 0.989>0.928）,说明FMIA优于本研究建立的ELSA方法。本研究在单一FMIA的基础上,将gE、gB微球偶联复合体置于同一反应体系中,建立并验证了可用于同时检测PRV gE、gB IgG抗体的双重FMIA方法,其与单一检测方法检测结果呈线性相关,可反应同一指标。综上所述,本研究利用原核表达载体pMAL-c5x对gE、gB进行可溶性表达,以制备的重组蛋白为抗原与微球偶联,分别建立gE、gB IgG抗体单一FMIA检测方法,并在此基础上建立了gE、gB的双重FMIA检测方法。该方法的建立可为进一步建立猪病毒病抗体多重检测方法奠定实验基础,为其他动物疫病抗体的新型血清学诊断技术的建立提供思路。