论文部分内容阅读
酶联免疫吸附法（ELISA）是一种被广泛认可且有效的免疫学检测方法,因其简单灵敏且易操作等优点赢得了人们的青睐。然而,传统的ELISA方法具有灵敏度相对不足、检测成本高、易出现假阳性等缺点,这极大地限制了它在早期诊断中的应用。此外,猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）作为一种常见的感染哺乳动物的病毒,自1998年被发现以来对全球猪行业造成了巨大的困扰,也给猪肉食品安全带来了风险。因此,针对猪圆环病毒Ⅱ型的检测,建立一种高灵敏度、低成本的方法将具有重要的实际意义。为了提高传统ELISA的测试性能,科研工作者做出了诸多努力。其中,纳米技术与ELISA结合的方法极大的提高了传统ELISA的性能,尤其是在灵敏度和准确度等方面。本文以ELISA作为基本分析方法,应用二氧化硅等硅基纳米材料设计了两种不同的ELISA信号标签,最终应用于猪圆环病毒Ⅱ型抗体的快速灵敏检测中,以期寻找一种稳定灵敏的信号探针进行市场化应用。本论文分三个部分展开,第一部分主要通过二氧化硅纳米微球负载量子点和酶标二抗实现信号放大来提高检测灵敏度,同时运用ELISA、荧光法和方波伏安法对同一待测物进行分析,进一步确保该方法的可靠性;第二部分运用Au-Pt/SiO2硅基纳米复合物作为信号标签实现ELISA的无酶检测,同时运用磁珠作为捕获剂减少信号标签的非特异性吸附,该方法在一定程度上降低了ELISA试剂盒的成本,同时提高了检测的灵敏度和准确度;第三部分主要基于H2O2还原HAuCl4形成金纳米颗粒的原理,发展了一种新的HAuCl4/H2O2可视化系统用于猪圆环病毒Ⅱ型抗体的检测,该方法改善了ELISA显色单一性的不足。全文研究内容概括如下:1.二氧化硅负载量子点用于PCV2抗体的分析检测提高ELISA的检测灵敏度对各种疾病的早期临床诊断具有重要意义,在第一部分工作中,基于二氧化硅纳米微球负载量子点和二抗,构建了一种通用的免疫检测信号标签。具体而言,首先将硒化镉（CdSe）量子点嵌入到硅球内部,然后在负载量子点的硅球外面包裹一层硅壳,接下来将辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗共价偶联到纳米硅球上,最后将制备好的信号标签应用到ELISA、荧光法和方波伏安法（SWV）中,三种方法相互印证,提高了检测结果的可靠性。为了进一步证明该免疫传感器的性能,本实验采用人IgG（HIgG）作为模型分析物,实验结果表明该方法可以较好地应用到生物样品的分析检测中。由于信号标签中包含了大量的HRP和CdSe量子点,与常规的ELISA方法相比,改进的ELISA法、荧光法和方波伏安法（SWV）的信号响应强度分别增加了5倍,200倍和400倍,它们对HIgG的检出限分别为3.9 ng/mL,0.1 ng/mL和0.05 ng/mL,相对标准偏差（RSD）低于5%。在对PCV2抗体的分析检测中,该方法的检测灵敏度增强了100倍,实验结果表明,该多功能免疫方法具有良好的灵敏度、稳定性和重现性,在临床诊断和生物食品检测中具有潜在的应用价值。2.Au-Pt/SiO2作为信号标签用于PCV2抗体的无酶免疫吸附检测法由于HRP难以承受高温和苛刻的pH条件,因此寻找一种能够替代HRP酶的催化剂并将其用于ELISA检测中具有十分重要的意义。第二部分内容报道了一种基于Au-Pt/SiO2纳米材料标记的高灵敏无酶免疫吸附方法（EFISA）用于PCV2抗体的快速检测。在此EFISA系统中,Au-Pt/SiO2通过湿化学法合成,具有较好的水溶性和过氧化氢类酶催化活性,Au-Pt/Si O2用来代替HRP与抗体相连作为信号标签,磁珠（MBs）偶联的抗原作为捕获剂用于捕获待测抗体,同时起到磁分离洗涤的效果。为了验证EFISA的性能,实验中以HIgG作为模型分析物,PCV2阳性血清作为实际样本应用到该系统的检验中。结果表明,与常规的ELISA相比,该EFISA法对HIgG的响应浓度可以低至75 pg/mL,相对于传统ELISA,其检测灵敏度提高了大约264倍。在无酶免疫分析中,Au-Pt/SiO2纳米材料首次被成功地应用到ELISA方法中,并在优化条件下实现了PCV2抗体的高倍稀释检测（5:107）。该EFISA方法具有低成本、易操作、可调节的催化活性等优势,使其在食品生物分析和临床诊断中具备广阔的应用价值。3.HAuCl4/H2O2可视化系统用于PCV2抗体的分析检测TMB/H2O2显色系统因其灵敏稳定的优点被广泛地应用于ELISA中,但是该方法存在的最大不足就是显色颜色单一,只能通过显色后颜色的深浅来判断待测物浓度的高低。此外,酶标二抗的催化活性也会影响ELISA的灵敏度。考虑到上述因素,本部分工作发展了一种基于Au-Pt/SiO2的HAuCl4/H2O2传感检测系统,以用于PCV2抗体的多色可视化检测。结合上述两部分的工作基础,利用Au-Pt/SiO2的过氧化物类酶活性催化分解H2O2,进而调控HAuCl4还原生成金纳米颗粒（Au NPs）的反应速率,实现了Au NPs的颜色变化。实验结果表明,随着Au-Pt/SiO2浓度的增加,还原得到的Au NPs颜色逐渐从酒红色变到浅紫色。因此,将二抗修饰的Au-Pt/SiO2作为信号标签,抗原修饰的磁珠作为捕获剂识别待测抗体,HAuCl4作为显色剂可以构建一个新的ELISA检测系统。该系统被成功的应用到PCV2抗体的稀释检测中,该方法的检测灵敏度比传统的ELISA提高了200倍,检测的最低稀释倍数可以达到107倍。