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背景和目的椎间盘退行性变(intervertebral disc degeneration,IDD)是颈椎病、腰椎间盘突出症等脊柱退变相关疾病的主要诱因。针对脊柱退变相关疾病,临床主要施以保守和手术治疗。保守治疗虽在一定程度上可缓解早期IDD的症状,但无法逆转已退变的椎间盘生物学功能;外科手术应用于IDD的晚期治疗中,也存在着无法恢复正常椎间盘高度及承重能力、造成现存椎间盘退变的恶化、甚至加速邻近椎体退化等诸多问题。因而在退变早期,探寻积极有效的防治途径,进而局限乃至阻逆IDD,具有重大意义。椎间盘由上下软骨终板(cartilaginous endplate,CEP)、中央部分的髓核(nucleus pulposus,NP)和外周的纤维环(annulus fibrosus,AF)三部分构成,其中髓核主要承受脊柱负重产生的压力,而纤维环主要承受脊柱轴向负荷和身体运动产生的多种应力。IDD最早发生于髓核,髓核细胞数量下降、功能减弱是退变的早期病理基础。关于髓核的退变机制及修复再生,目前已经取得了一系列研究成果,但仍难以有效应用于改善IDD。究其原因,主要是缺少椎间盘的另一组成-纤维环退变/破裂后的修复,而维持纤维环结构和功能的完整性对于负载条件下保持髓核的形态位置及维持椎间盘内生理压力至关重要。由此可见,在IDD早期有效地促进纤维环再生与修复,进而加固纤维环以防止退变髓核的进一步突出,有望为IDD提供高效的防治手段。IDD是多种因素作用的结果,如生物力学、遗传、营养剥夺、炎症等,其中过度压力被认为是IDD的首要诱因。自噬作为一种重要的细胞程序性死亡方式,在调控细胞增殖、分化、衰老及死亡等方面极为关键,被证实与多种退变性疾病密切相关。自噬也被报道存在于IDD中,在退变过程中可能发挥着“双刃剑”作用,其正逐渐成为IDD领域的研究热点。材料与方法(1)纤维环细胞培养体系的构建:分离、培养大鼠纤维环细胞,构建可控压力低氧细胞培养体系。(2)Wnt/β-catenin信号通路调控纤维环细胞自噬的作用研究:抑制或过表达Wnt/β-catenin信号通路关键分子后,检测纤维环细胞自噬水平,检测成软骨、成骨相关指标。(3)自噬调控Wnt/β-catenin信号通路的作用研究:抑制或过表达自噬途径关键分子后,检测纤维环细胞Wnt/β-catenin信号通路关键分子的表达,检测成软骨、成骨相关指标。(4)构建大鼠尾椎可控加压模型。(5)Wnt/β-catenin信号通路与自噬途径相关检测:不同压力强度下,从基因、蛋白等水平检测尾椎间盘组织Wnt/β-catenin信号通路、自噬途径关键分子表达。(6)成软骨、成骨相关检测:不同压力强度下,检测成软骨、成骨相关指标。(7)Wnt/β-catenin信号通路调控自噬相关研究:分别注射负载Wnt/β-catenin信号通路抑制剂、激活剂的KLPP于大鼠尾椎椎间盘,不同压力强度下,检测自噬水平及成软骨、成骨性能,并分析其内在关联。(8)自噬调控Wnt/β-catenin信号通路相关研究:分别注射负载自噬抑制剂、激活剂的KLPP于鼠尾椎椎间盘,检测Wnt/β-catenin信号通路活性及成软骨、成骨性能,并分析其内在关联。(9)采用SPSS 21.0统计学软件对上述数据进行统计学处理,实验所得数据采取均值±标准差(Mean±SD)来表述。多样本均数的比较采用单因素方差分析,两组间均数的比较采用双样本均数的t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)压力-低氧干预纤维环细胞0h、6h、12h、24h后,蛋白质印迹(western blot,WB)及反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测显示自噬关键分子LC3B、Beclin1表达水平逐渐升高,MDC(反映自噬)阳性率亦逐渐升高。(2)压力-低氧干预纤维环细胞0h、6h、12h、24h后,LDH及CCK-8检测均显示,自噬抑制剂3-MA可促进增强LDH释放活性(反映细胞死亡),3-MA可同时降低CCK-8水平(反映细胞活性),表明自噬起保护纤维环细胞的作用。(3)大鼠尾椎加压0周、2周后,免疫组化检测显示Wnt/β-catenin信号通路关键分子Wnt3a及Wnt/β-catenin表达均逐渐上调;Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达均下调;提示Wnt/β-catenin信号通路的激活与IDD可能呈负相关。(4)压力-低氧干预纤维环细胞0h、6h、12h、24h后,Western blot及RTPCR检测显示Wnt/β-catenin信号通路关键分子Wnt3a及β-catenin表达均逐渐上调。(5)压力-低氧干预0h、6h、12h、24h后,LDH及CCK-8检测均显示,Wnt/β-catenin抑制剂IWP-2抑制纤维环细胞死亡,Wnt/β-catenin激活剂Li Cl加剧纤维环细胞死亡,提示Wnt/β-catenin信号通路激活可能与IDD呈正相关。(6)Calcein-AM/PI染色及定量显示:新型多肽自组装凝胶材料KLPP比传统多肽自组装凝胶材料KLD-12具备更好的生物相容性,对软骨细胞毒性小,且能促进细胞增殖。较KLD-12,新型的KLPP更能促进软骨细胞从其内部迁移到表面,孔隙率适宜,可作为良好的药物缓释载体。结论压力-低氧条件下,Wnt/β-catenin信号通路与纤维环细胞自噬呈负相关;压力-低氧条件下,Wnt/β-catenin信号通路、自噬与纤维环细胞成软骨、成骨活性密切相关;压力-低氧条件下,通过调控Wnt/β-catenin信号通路以调节自噬水平,最终达到促进纤维环软骨化、骨化。