为探索端粒酶5′调控序列甲基化水平和干扰RNA对端粒酶活性的影响,本课题以马立克氏病肿瘤细胞系MDCC-MSB1为体外研究对象,首先克隆了端粒酶反转录酶的5′调控序列,测序后与GenBank的序列进行了比对,应用分子生物学软件对其转录结合位点进行了分析,并与人的作了比较。以CEF细胞作对照,通过限制性酶切-PCR法和甲基化特异性-PCR(MSP)法对端粒酶调控序列部分位点的甲基化水平进行了分析。然后通过设计针对chTERT mRNA的特异siRNA,分别用体外转录和质粒表达两种方式,获得了针对chTERT mRNA的siRNA,导入MDCC-MSB1细胞后分别应用本室改进的TRAP法、流式细胞仪以及Real-time RT-PCR(相对定量)TaqMan探针法对转染后MDCC-MSB1细胞端粒酶活性、细胞周期分布变化和chTERT mRNA的表达水平进行了检测,结果发现MDCC-MSB1中chTERT调控序列甲基化水平远低于CEF,CpG岛的低甲基化是chTERT高表达的限速步骤。转录制备的siRNA-1、siRNA-3在转染细胞后有效抑制了chTERT mRNA的表达,表达水平分别下降了68%和81%,端粒酶活性明显降低,细胞周期被阻滞在G0/G1期。筛选得到的shRNA重组表达质粒shRNA1和shRNA3转染细胞72h后,chTERT mRNA表达水平分别下降了66%和89%,表明转录的siRNA和shRNA重组表达质粒均有效地抑制了chTERT mRNA的表达,端粒酶活性明显降低的同时,细胞周期由G0/G1期向S期转变被阻滞。