水稻立枯丝核菌(R.solani)是丝核菌属(Rhizoctonia)的一个种,为半知菌亚门真菌,其分布广、寄主范围大,不产生无性孢子,常以菌核形态习居土壤,是玉米、水稻、草坪草、马铃薯等农作物和纹枯病的致病菌。根据菌丝融合与否,立枯丝核菌可划分为14个融合群(AG-1—AG-13和AG-BI)。1987年。Ogoshi等根据培养性状、寄主以及生理生化等特性分成不同的种内类群(Intraspecificgroup,ISG),其中的一个融合群AG-1划分AG-1IA、AG-1IB、AG-1IC三个亚群。立枯丝核菌的AG-1IA亚群是水稻和玉米纹枯病的优势致病菌群,纹枯病在我国长江流域高温、高湿条件下年年发生,是水稻和玉米等农作物年年减产的主要因素之一。在四川,立枯丝核菌也造成水稻、玉米严重减产。因此,充分认识我省水稻立枯丝核菌(R.solani)生理小种变化的特点,进行综合防治立枯丝核菌,提高抗病育种水平显得尤其重要。G蛋白是膜协同、异三聚体蛋白,由α、β、γ3个亚单位组成。G蛋白及其受体(GPCRs)组成了真核生物细胞里最流行的信号系统、感官多样调节系统、细胞生长和激素调节系统。G蛋白β亚基呈现出一种桶形β折叠结构,并包含WD40重复序列,其前端具有N端α螺旋,是G蛋白功能GTP连接转换器。Gilman等研究表明,在真核生物中G蛋白β亚基基因参与信号传导途径,导致基因表达、细胞功能受到影响。在很多能对植物致病的病原真菌,如Dictyosteliumdiscoideum、Ustilagomaydis和Fusarium oxysporum中,G蛋白在整个代谢生长过程中都起着举足轻重的作用,涉及细胞生长、分化和毒性等。Kasahara等对Cryphonectria parasitica的研究发现,G蛋白β亚基基因功能丧失转基因菌株的菌丝缺乏明显分叉,对植物侵染和致病力明显降低。本研究从四川不同生态区分离到水稻立枯丝核致病菌55株,研究其遗传分化、致病力分化和聚类分析,并利用同源克隆方法分离水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因,对其功能做了些初步的研究,为研究水稻立枯丝核菌致病机理和对应防治方法奠定基础。实验主要结果如下:1.通过水琼脂分离法共得到水稻立枯丝核菌菌株55株。2.水稻立枯丝核菌菌丝融合:所有分离全部菌株中除D42都与标准菌株AG-1IA发生菌丝融合。部分菌株不仅仅能与其中的一种标准菌株发生菌丝融合,而且还能同时与其它一种或者多种标准菌株发生菌丝融合,这说明在细胞学水平上,这些立枯丝核菌具有多个菌群归属性,因此这类立枯丝核菌为桥梁菌群。3.水稻立枯丝核菌致病力鉴定:室内采用离体叶片接种法,分别接种X400、蜀恢527R、蜀恢881R。结果表明,各菌株间致病力差异显著。田间采用始穗期嵌入接种法,结果表明,各菌株间致病力差异显著。同时发现,相同菌株同时接种三种材料时,室内离体鉴定方法的致病力对不同材料差异较小,而活体接种方法表现出很大的材料间差异。4.RAPD分子标记聚类分析:结果显示,在相似系数0.91处,除D42、D54以外的所有分离菌株与AG-1IA可聚为一类,而外群对照菌株A-1和另外9个国际标准菌株分别归属一类。以相似系数0.941为标准,可以把55个水稻立枯丝核菌菌株为8类:D1、D35、D6等40个为第1类;D36、D39、D40、D46、D41为第2类;D7和D20第3类;D37和D50为第4类:D2和D3为第5类;D47和D55为第6类;D42为第7类;D54为第8类。5.水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的同源克隆:利用衍生自T.cucumerisG蛋白β亚基基因序列的特异引物,对水稻立枯丝核菌菌株DNA进行PCR扩增。产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可以观察到一条约1.9 kb大小的扩增带,与预期的G蛋白β亚基基因大小相吻合。经测序表明该片段为水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的扩增产物。softberry软件分析证实,该序列包含一个约1.7kb的完整开放阅读框,编码366个氨基酸。6.G蛋白beta亚基基因多态性及进化分析:对11个水稻立枯丝核菌菌株的G蛋白β亚基基因氨基酸序列作同源性比较。结果发现,他们之间同源性较高,但是,在某些区间发生变异。进化分析发现该序列与大量物种G蛋白β亚基基因明显同源,一致性介于88.14-57.34%。7.基因的表达模式分析:通过半定量RT-PCR法对水稻立枯丝核菌AG-1IA G蛋白β亚基基因在不同时期的表达量分析显示,水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因在前2 d几乎不表达,从第3天到第5天基因的表达量逐渐增大,在第5天时达到最大,第6天后表达量陡然降低到几乎不表达。因此,水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因在对数生长期表达量最大,提示水稻立枯丝核菌AG-1IA G蛋白β亚基基因可能具有时空表达特性。