近些年,食物过敏现象频发,过敏人群数量日益增多,而食物过敏方面的作用机理还未被完全阐述,斑马鱼模型作为四大模式生物之一,在免疫学方面得到广泛应用。因此本研究利用斑马鱼建立食物过敏模型。通过以原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)、精胺酸激酶(Arginine kinase,AK)、卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)、马铃薯酸性磷酸酶(Potato acid phosphatase,PAP)、胶原蛋白(Collagen,COL)5种过敏原,通过饲料喂养等方式喂养6周龄斑马鱼,实验周期15天。通过组织切片观察各组斑马鱼前肠、中肠和后肠的病理结构以及杯状细胞和肥大细胞;通过荧定量检测筛选巴斑马鱼脾脏、肝脏以及肠道中的生物分子标志物;通过16S扩增子测序筛选斑马鱼肠道的优势菌群和菌群标志物;通过荧定量检测斑马鱼Toll样受体(Toll-like receptor)来了解斑马鱼对食物过敏原的识别机制,核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路和NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)与抗氧化反应元件(ARE)激活机制和反向调控机制;通过从过敏时间和过敏原浓度两方面优化斑马鱼的过敏方案;利用小清蛋白、小麦蛋白和大豆蛋白对已建立的斑马鱼食物过敏模型进行验证,检测其生物标志物以及肠道菌群的结构,与模型指标进行综合比较,确定斑马鱼过敏模型的实用性。主要研究结果如下:(1)五种蛋白刺激对斑马鱼肠道有损伤反应:根据切片图以及肠道症状评分图,AK组、COL组、OVA组、PAP组和TM组5组致敏组对比对照组(Control check,CK)发现,致敏组肠道均出现不同程度的损伤,主要包括肠绒毛脱落和糜烂,肌层不同程度病变,前肠部位杯状细胞聚集明显,前肠和中肠部位损伤较为严重,后肠相对保持完好,且COL和OVA蛋白对斑马鱼肠道的损伤情况较为严重;(2)脾脏、肝脏生物标志物筛选:通过对斑马鱼的免疫相关生物标志物的检测,在斑马鱼脾脏中,发现白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、补体蛋白(Complement protein,C3)表达量明显上升,IL-6、IL-10、IL-4/13B和CC-chemokine编码基因表达量下降且有显著差异,这些蛋白在斑马鱼炎症、特异性免疫以及补体系统中都起到了关键作用,表明斑马鱼产生相应的免疫反应,可将6个基因作为斑马鱼食物过敏反应模型脾脏中的生物标志物进行检测;在斑马鱼肝脏中,筛选出了IL-22、IL-23、IL-17AF3、CC-chemokine和主要组织相容性复合体Ⅰ(Major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)五种生物标志物,这些标志物在5种蛋白致敏斑马鱼中在其肝脏基因表达量均一致明显下调,这可能是因为这些生物标志物对致敏蛋白刺激较为敏感,由此可得,IL-22、IL-23、IL-17AF3、CCchemokine和MHC-Ⅰ可以作为斑马鱼食物过敏反应模型中肝脏器官中的生物标志物;(3)5种蛋白致敏可能与斑马鱼的肠道菌结构变化有关:与CK组相比,5组实验组具有相同增长趋势的有鲸杆菌属(Cetobacterium)和副拟杆菌属(Parabacteroides);具有相同减少趋势的有叶杆菌属(Phyllobacterium);鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas);气单胞菌属(Aeromonas);其中,鲸杆菌属(Cetobacterium)在各致敏组中的增长最为明显,鲸杆菌属(Cetobacterium)成为主要优势菌群,这可能与食物过敏反应有关;(4)斑马鱼特有TLRs识别受体被部分激活:通过利用OVA和COL致敏斑马鱼,发现在脾脏中斑马鱼特有TLRs(TLR21.1、TLR21.2、TLR21.3和TLR21.4)未被激活,而在肝脏中,COL过敏斑马鱼时该识别受体被明显激活,表达上调,这可能是斑马鱼应对过敏反应时触发斑马鱼自身特有免疫因子,目前该受体所参与的免疫反应和通路未知,有待于进一步研究;(5)COL和OVA致敏斑马鱼时NF-κB通路、Nrf2/ARE通路被激活:COL过敏斑马鱼是通过依赖接头蛋白启动其适应性免疫抵御外来刺激;OVA增强了斑马鱼TLR4受体基因的表达激活核转录因子NF-κB,说明了NF-κB对COL和OVA的刺激产生了免疫应答;当COL和OVA刺激斑马鱼时,Nrf2/ARE机制被激活,作为重要的防御途径发挥免疫应答的作用,这些通路变化进一步证实了挑选的生物标志物在理论上的合理性;(6)食物过敏原浓度及致敏时间的优化:在脾脏和肝脏中,COL和OVA组10%浓度过敏对6种生物标志物都具有显著性差异,优于其他浓度的过敏效果,故10%为最适过敏浓度;与浓度优化相同,在致敏时间的优化中,对筛选出的标志物进行表达量的检测,得出结论是15 d的致敏效果最佳。