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小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病是影响小麦生产最严重的病害之一。研究小麦叶锈菌的致病机理对控制小麦叶锈病84的流行具有重要的意义。本研究使用小麦叶锈菌致病类型为THTT的生理小种的休眠夏孢子、萌发夏孢子、与TcLr19感叶锈病突变体M433-3-11-2亲和互作早期(包括互作6h、12h和24h)、互作6d时期的转录组测序数据构建的cDNA文库进行差异基因的筛选。筛选了休眠夏孢子时期与萌发时期、亲和互作早期与萌发时期、互作6d与互作早期的差异基因，筛选出各个阶段的效应蛋白并选择部分效应蛋白进行功能验证。试验数据涵盖叶锈菌孢子萌发至亲和互作后期叶锈菌的生理周期，筛选出了大量差异基因及效应蛋白，并对部分效应蛋白进行功能分析，为揭示叶锈菌的萌发过程及叶锈菌侵染小麦的机理奠定基础。本研究的具体试验结果如下:
1、明确了小麦叶锈菌夏孢子休眠与萌发的表达差异萌发夏孢子时期相比休眠夏孢子时期上调表达的差异基因主要涉及细胞进程、有机物代谢、信号传导、单组织过程、催化酶活性等;下调基因主要涉及单组织过程、单个有机体细胞过程、有机物代谢过程、催化活性调节等过程。
2、明确了小麦叶锈菌萌发与侵染寄主时期的表达特性小麦叶锈菌与M433-3-11-2亲和互作早期相比孢子萌发时期差异基因集中在催化活性、阴离子结合、核苷酸结合、嘌呤核酸结合、嘌呤核苷酸结合、激酶活性调节、氧化还原过程和磷酸化等过程;叶锈菌与M433-3-11-2互作6d时期与互作早期差异基因功能主要涉及代谢过程、催化活性、细胞过程、单组织过程、高分子配合物、核酸结合和水解酶活性。
3、筛选了自叶锈菌休眠夏孢子阶段至与寄主亲和互作6d时期的候选效应蛋白利用生物信息学方法在整个cDNA文库中筛选效应蛋白，共筛选出780个候选效应蛋白，其中在休眠孢子时期表达的有304个，孢子萌发时期表达的有299个，锈菌与小麦互作早期表达的有646个，而互作6d时期表达的效应蛋白有705个，验证了效应蛋白在吸器产生时期大量表达的猜想。
4、通过异源表达筛选获得12个候选效应蛋白根据基因表达时期与表达量的不同，利用异源表达系统对13个效应蛋白进行其毒性或无毒性验证。其中Pt84114在孢子萌发时期与互作早期大量表达;Pt21637在互作早期大量表达;其余11个基因属于互作6d与互作早期的上调差异基因，在互作6d时期大量表达。将分别含有13个候选效应基因质粒的农杆菌注射本氏烟草，发现这13个基因均未引起烟草的坏死反应;将之与小鼠促凋亡基因(BAX)共同注射烟草，结果发现，除基因Pt133211外，其余12个基因均能在烟草上抑制BAX诱导的程序性细胞死亡(PCD)，证明12个候选效应蛋白具有毒性作用，并利用生物信息学软件明确了12个候选效应蛋白的序列特点。
5、分析了13个基因的表达特性选取孢子萌发时期10个差异基因与3个效应蛋白基因进行qRT-PCR分析基因各个时期表达量，发现13个基因的定量分析结果与基因数字表达谱分析结果一致。
6、通过HIGS分析探测了3个候选效应蛋白的功能利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)在抗叶锈近等基因系上分别沉默基因Pt84114、Pt21637和Pt98252。利用qPCR技术检测沉默效率发现，三个基因在24h、48h和120h的表达量相比对照组均明显下降。对沉默后的锈菌表型进行观察发现，在沉默Pt84114后，叶锈菌THTT在TcLr14b上的表现型由“4”转变为“1”;沉默Pt98252后锈菌在TcLr44上的表现型由“3”转变为“1”;沉默Pt21637后THTT在Thatcher上的表现型由“4”变为“3”。对锈菌组织进行显微观察发现，沉默基因Pt84114影响THTT侵染TcLr14b过程中气孔下囊、菌丝及吸器的形成与发育过程，该基因的沉默推迟并影响了气孔下囊的膨大，同时减少菌丝的生长量和吸器的数量;沉默基因Pt98252后，在THTT侵染TcLr44的过程中，推迟了叶锈菌侵染的进程，主要表现为推迟附着胞与气孔下囊产生时间，并明显抑制了吸器体积的增大;沉默基因Pt21637影响THTT侵染Tc过程中气孔下囊的产生时间。HIGS试验结果说明三个效应蛋白在锈菌侵染寄主过程中起到毒性作用。
7、确定了效应蛋白Pt84114和Pt98252的作用位置Pt84114和Pt98252均布满整个细胞，推测两个效应蛋白被叶锈菌分泌至寄主细胞，在寄主细胞发挥作用。
8、分析了Pt84114和Pt98252的结构特点获得并通过蛋白杂交检测效应蛋白Pt84114(去信号肽)和Pt98252(去信号肽)，构建两个蛋白的模拟三级结构的模式图。通过分析可知Pt84114等电点为5.95，工作环境偏酸性。蛋白富含半胱氨酸，含有三级结构含有α-螺旋与β折叠，蛋白为不稳定蛋白，易发生变异;Pt98252等电点为7.93，工作环境偏碱性，三级结构富含α-螺旋，结构十分稳定。两种蛋白均表现为亲水性。
研究表明在病原菌的不同阶段，均有多种不同的通路参与，不同阶段表达特性差异明显。各个阶段都会有效应蛋白，其中互作6d时效应蛋白数量最多。效应蛋白可能参与附着胞、吸器形成和菌丝的生长等多种功能。Pt84114、Pt21637和Pt98252是在小麦叶锈菌生长发育过程中重要的致病相关基因，其中Pt84114和Pt98252分别为Lr14b和Lr44的毒性相关基因，试验结果为研究小麦叶锈菌致病机理奠定了基础。
1、明确了小麦叶锈菌夏孢子休眠与萌发的表达差异萌发夏孢子时期相比休眠夏孢子时期上调表达的差异基因主要涉及细胞进程、有机物代谢、信号传导、单组织过程、催化酶活性等;下调基因主要涉及单组织过程、单个有机体细胞过程、有机物代谢过程、催化活性调节等过程。
2、明确了小麦叶锈菌萌发与侵染寄主时期的表达特性小麦叶锈菌与M433-3-11-2亲和互作早期相比孢子萌发时期差异基因集中在催化活性、阴离子结合、核苷酸结合、嘌呤核酸结合、嘌呤核苷酸结合、激酶活性调节、氧化还原过程和磷酸化等过程;叶锈菌与M433-3-11-2互作6d时期与互作早期差异基因功能主要涉及代谢过程、催化活性、细胞过程、单组织过程、高分子配合物、核酸结合和水解酶活性。
3、筛选了自叶锈菌休眠夏孢子阶段至与寄主亲和互作6d时期的候选效应蛋白利用生物信息学方法在整个cDNA文库中筛选效应蛋白，共筛选出780个候选效应蛋白，其中在休眠孢子时期表达的有304个，孢子萌发时期表达的有299个，锈菌与小麦互作早期表达的有646个，而互作6d时期表达的效应蛋白有705个，验证了效应蛋白在吸器产生时期大量表达的猜想。
4、通过异源表达筛选获得12个候选效应蛋白根据基因表达时期与表达量的不同，利用异源表达系统对13个效应蛋白进行其毒性或无毒性验证。其中Pt84114在孢子萌发时期与互作早期大量表达;Pt21637在互作早期大量表达;其余11个基因属于互作6d与互作早期的上调差异基因，在互作6d时期大量表达。将分别含有13个候选效应基因质粒的农杆菌注射本氏烟草，发现这13个基因均未引起烟草的坏死反应;将之与小鼠促凋亡基因(BAX)共同注射烟草，结果发现，除基因Pt133211外，其余12个基因均能在烟草上抑制BAX诱导的程序性细胞死亡(PCD)，证明12个候选效应蛋白具有毒性作用，并利用生物信息学软件明确了12个候选效应蛋白的序列特点。
5、分析了13个基因的表达特性选取孢子萌发时期10个差异基因与3个效应蛋白基因进行qRT-PCR分析基因各个时期表达量，发现13个基因的定量分析结果与基因数字表达谱分析结果一致。
6、通过HIGS分析探测了3个候选效应蛋白的功能利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)在抗叶锈近等基因系上分别沉默基因Pt84114、Pt21637和Pt98252。利用qPCR技术检测沉默效率发现，三个基因在24h、48h和120h的表达量相比对照组均明显下降。对沉默后的锈菌表型进行观察发现，在沉默Pt84114后，叶锈菌THTT在TcLr14b上的表现型由“4”转变为“1”;沉默Pt98252后锈菌在TcLr44上的表现型由“3”转变为“1”;沉默Pt21637后THTT在Thatcher上的表现型由“4”变为“3”。对锈菌组织进行显微观察发现，沉默基因Pt84114影响THTT侵染TcLr14b过程中气孔下囊、菌丝及吸器的形成与发育过程，该基因的沉默推迟并影响了气孔下囊的膨大，同时减少菌丝的生长量和吸器的数量;沉默基因Pt98252后，在THTT侵染TcLr44的过程中，推迟了叶锈菌侵染的进程，主要表现为推迟附着胞与气孔下囊产生时间，并明显抑制了吸器体积的增大;沉默基因Pt21637影响THTT侵染Tc过程中气孔下囊的产生时间。HIGS试验结果说明三个效应蛋白在锈菌侵染寄主过程中起到毒性作用。
7、确定了效应蛋白Pt84114和Pt98252的作用位置Pt84114和Pt98252均布满整个细胞，推测两个效应蛋白被叶锈菌分泌至寄主细胞，在寄主细胞发挥作用。
8、分析了Pt84114和Pt98252的结构特点获得并通过蛋白杂交检测效应蛋白Pt84114(去信号肽)和Pt98252(去信号肽)，构建两个蛋白的模拟三级结构的模式图。通过分析可知Pt84114等电点为5.95，工作环境偏酸性。蛋白富含半胱氨酸，含有三级结构含有α-螺旋与β折叠，蛋白为不稳定蛋白，易发生变异;Pt98252等电点为7.93，工作环境偏碱性，三级结构富含α-螺旋，结构十分稳定。两种蛋白均表现为亲水性。
研究表明在病原菌的不同阶段，均有多种不同的通路参与，不同阶段表达特性差异明显。各个阶段都会有效应蛋白，其中互作6d时效应蛋白数量最多。效应蛋白可能参与附着胞、吸器形成和菌丝的生长等多种功能。Pt84114、Pt21637和Pt98252是在小麦叶锈菌生长发育过程中重要的致病相关基因，其中Pt84114和Pt98252分别为Lr14b和Lr44的毒性相关基因，试验结果为研究小麦叶锈菌致病机理奠定了基础。