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棉花是世界上最重要的经济作物之一，高产优质棉花的选育是棉花生产的关键。棉花杂种优势是棉花育种最有效的途径，胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)系应用于“三系”杂交育种系统，该系统是杂种优势的优良育种体系，对提高作物产量具有巨大的潜力。本文从陆地棉胞质雄性不育系C2P5A与其保持系C2P5B花器形态学、花药细胞学、生理生化、mRNA、长链非编码RNA(long non coding RNA, lncRNA)及蛋白质组学方面进行了研究，观察花药败育时期及特征，鉴定参与花药败育主要途径的差异表达mRNA、差异表达lncRNA和差异表达蛋白。通过对陆地棉胞质雄性不育系C2P5A败育机理的探讨，为杂种优势的利用提供坚实的理论基础。主要研究结果如下：
1.胞质雄性不育系C2P5A花药败育主要发生在四分体时期，且与部分物质代谢和抗氧化酶活性有关。观察胞质雄性不育系C2P5A和其保持系C2P5B花器官，不育系的花器官明显较小，花丝短，花药上无黏着花粉，且花粉粒活性很弱。采集棉花不同大小的花蕾，进行镜检和石蜡切片观察，花蕾纵长＜2.9mm为造孢细胞时期，3.0～4.0mm为花粉母细胞时期，4.1～5.0mm为四分体时期，5.1～6.0mm为单核时期，6.1～8.0mm为双核时期，＞8.1mm为成熟花粉粒时期，花蕾纵长(花托到花蕾顶端的长度，mm)。观察花药的细胞显微结构，不育系花药败育主要发生在四分体时期，绒毡层细胞发育异常、退化、程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)延迟或功能变化，导致C2P5A花药四分体时期不能形成四分体，最终使花药形成无花粉粒的花粉囊。生理生化研究结果表明，棉花胞质雄性不育与部分物质代谢和抗氧化酶活性有关。比较两系花药发育同一时期，不育系C2P5A的可溶性糖、可溶性蛋白质及脯氨酸含量低于保持系C2P5B；过氧化物酶(POD)活性不育系在败育前比保持系高，在花药败育前即花粉母细胞时期，过氧化氢酶(CAT)活性极显著低于保持系，丙二醛(MDA)在不育系中的含量比同时期保持系高。
2.筛选出的差异表达基因与棉花胞质雄性不育系C2P5A败育有关。采集花粉母细胞时期(pollen mother cell stage, Pms)、四分体时期(tetrad stage, Tds)、单核时期(mononuclear stage, Ms)的花药，提取总RNA进行转录组测序。总共收集到178166个转录本，其中新转录本74292个，已知转录本103874个，依据阈值|log2Ratio|≥2，readnum＞3，p≤0.001和FDR＜0.001，以及去掉没有注释的KEGG通路、GO等作为筛选差异基因的标准。三个时期共筛选出2013个差异表达基因(differentiallyexpressed genes, DEGs)。经过生物信息学及加权相关网络分析(weighted correlation network analysis, WGCNA)，许多DEGs参与淀粉和蔗糖代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、谷胱甘肽代谢和丙酮酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化以及脂肪酸代谢途径。其中鉴定出43个DEGs与活性氧(Reactive oxygen Species, ROS)迸发有关，73个DEGs与绒毡层发育有关。
3.胞质雄性不育系C2P5A败育受差异表达lncRNA调控。利用lncRNA-sequencing(lncRNA-seq)技术获lncRNA数据。按照阈值|log2Ratio|≥2，readnum＞5，p≤0.001，FDR＜0.001的为条件筛选差异表达lncRNA，并筛选差异表达lncRNA上、下游20kbp范围内的的顺式(cis)靶基因，鉴定出865个差异表达lncRNA通过1172个cis靶基因参与调控棉花花药发育的主要代谢途径，氧化磷酸化(ko00190)、类黄酮生物合成(ko00941)、戊糖和葡糖醛酸盐相互转化(ko00040)、脂肪酸生物合成(ko00061)代谢途径等。选取与育性有关的差异表达lncRNA进行荧光定量PCR验证，与lncRNA-seq结果一致。
4.胞质雄性不育系C2P5A败育代谢途径受差异表达蛋白质调控。采用数据独立采集(Dataindependent acquisition，DIA)又称SWATH定量蛋白质组技术对Pms、Tds、Ms时期的花药进行蛋白质测序。作为DIA定量的谱图库，数据依赖性获取(data-dependent acquisition, DDA)谱图库包含88974个肽段，15960个蛋白质。根据|Log2Foldchange|≥2和FDR＜0.01进行筛选差异表达蛋白(differentially expressed protein, DEPs)。花药发育三个时期共鉴定194个DEPs水平上调，304个DEPs水平下调，共交集79个DEPs，约70%的DEPs在拟南芥中都能找到同源性。DEPs经过分析，参与棉花花药发育的主要代谢途径，如15个DEPs参与糖酵解途径(ko00010)，9个DEPs参与丙酮酸代谢(ko00620)，22个DEPs参与淀粉和蔗糖代谢(ko00500)，8个DEPs参与脂肪酸代谢(ko00061，ko00071，ko00071)；12个DEPs参与类黄酮生物合成过程(ko00941)。
转录组和蛋白质组数据联合分析相关性较低，每个比对组的所有关联上的mRNA和蛋白质的表达量相关性较低，相关系数约为0.23。随机筛选与育性相关的12个差异蛋白进行实时荧光定量PCR，与蛋白质组测序结果相一致。
5.通过VIGS技术诱导目的基因沉默，对棉花育性有一定的影响。利用VIGS技术对选出的4个目的基因Ghir_D12G015670.1，Ghir_D04G004080.3，Ghir_A02G010860.1，Ghir_D07G019990.1沉默，花药发育情况与对照相比，花柱裸露较多，花丝变短，花粉较少。控制棉花育性关键的关键基因和蛋白质，仍需要进一步筛选和深入研究。
1.胞质雄性不育系C2P5A花药败育主要发生在四分体时期，且与部分物质代谢和抗氧化酶活性有关。观察胞质雄性不育系C2P5A和其保持系C2P5B花器官，不育系的花器官明显较小，花丝短，花药上无黏着花粉，且花粉粒活性很弱。采集棉花不同大小的花蕾，进行镜检和石蜡切片观察，花蕾纵长＜2.9mm为造孢细胞时期，3.0～4.0mm为花粉母细胞时期，4.1～5.0mm为四分体时期，5.1～6.0mm为单核时期，6.1～8.0mm为双核时期，＞8.1mm为成熟花粉粒时期，花蕾纵长(花托到花蕾顶端的长度，mm)。观察花药的细胞显微结构，不育系花药败育主要发生在四分体时期，绒毡层细胞发育异常、退化、程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)延迟或功能变化，导致C2P5A花药四分体时期不能形成四分体，最终使花药形成无花粉粒的花粉囊。生理生化研究结果表明，棉花胞质雄性不育与部分物质代谢和抗氧化酶活性有关。比较两系花药发育同一时期，不育系C2P5A的可溶性糖、可溶性蛋白质及脯氨酸含量低于保持系C2P5B；过氧化物酶(POD)活性不育系在败育前比保持系高，在花药败育前即花粉母细胞时期，过氧化氢酶(CAT)活性极显著低于保持系，丙二醛(MDA)在不育系中的含量比同时期保持系高。
2.筛选出的差异表达基因与棉花胞质雄性不育系C2P5A败育有关。采集花粉母细胞时期(pollen mother cell stage, Pms)、四分体时期(tetrad stage, Tds)、单核时期(mononuclear stage, Ms)的花药，提取总RNA进行转录组测序。总共收集到178166个转录本，其中新转录本74292个，已知转录本103874个，依据阈值|log2Ratio|≥2，readnum＞3，p≤0.001和FDR＜0.001，以及去掉没有注释的KEGG通路、GO等作为筛选差异基因的标准。三个时期共筛选出2013个差异表达基因(differentiallyexpressed genes, DEGs)。经过生物信息学及加权相关网络分析(weighted correlation network analysis, WGCNA)，许多DEGs参与淀粉和蔗糖代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、谷胱甘肽代谢和丙酮酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化以及脂肪酸代谢途径。其中鉴定出43个DEGs与活性氧(Reactive oxygen Species, ROS)迸发有关，73个DEGs与绒毡层发育有关。
3.胞质雄性不育系C2P5A败育受差异表达lncRNA调控。利用lncRNA-sequencing(lncRNA-seq)技术获lncRNA数据。按照阈值|log2Ratio|≥2，readnum＞5，p≤0.001，FDR＜0.001的为条件筛选差异表达lncRNA，并筛选差异表达lncRNA上、下游20kbp范围内的的顺式(cis)靶基因，鉴定出865个差异表达lncRNA通过1172个cis靶基因参与调控棉花花药发育的主要代谢途径，氧化磷酸化(ko00190)、类黄酮生物合成(ko00941)、戊糖和葡糖醛酸盐相互转化(ko00040)、脂肪酸生物合成(ko00061)代谢途径等。选取与育性有关的差异表达lncRNA进行荧光定量PCR验证，与lncRNA-seq结果一致。
4.胞质雄性不育系C2P5A败育代谢途径受差异表达蛋白质调控。采用数据独立采集(Dataindependent acquisition，DIA)又称SWATH定量蛋白质组技术对Pms、Tds、Ms时期的花药进行蛋白质测序。作为DIA定量的谱图库，数据依赖性获取(data-dependent acquisition, DDA)谱图库包含88974个肽段，15960个蛋白质。根据|Log2Foldchange|≥2和FDR＜0.01进行筛选差异表达蛋白(differentially expressed protein, DEPs)。花药发育三个时期共鉴定194个DEPs水平上调，304个DEPs水平下调，共交集79个DEPs，约70%的DEPs在拟南芥中都能找到同源性。DEPs经过分析，参与棉花花药发育的主要代谢途径，如15个DEPs参与糖酵解途径(ko00010)，9个DEPs参与丙酮酸代谢(ko00620)，22个DEPs参与淀粉和蔗糖代谢(ko00500)，8个DEPs参与脂肪酸代谢(ko00061，ko00071，ko00071)；12个DEPs参与类黄酮生物合成过程(ko00941)。
转录组和蛋白质组数据联合分析相关性较低，每个比对组的所有关联上的mRNA和蛋白质的表达量相关性较低，相关系数约为0.23。随机筛选与育性相关的12个差异蛋白进行实时荧光定量PCR，与蛋白质组测序结果相一致。
5.通过VIGS技术诱导目的基因沉默，对棉花育性有一定的影响。利用VIGS技术对选出的4个目的基因Ghir_D12G015670.1，Ghir_D04G004080.3，Ghir_A02G010860.1，Ghir_D07G019990.1沉默，花药发育情况与对照相比，花柱裸露较多，花丝变短，花粉较少。控制棉花育性关键的关键基因和蛋白质，仍需要进一步筛选和深入研究。