基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重要酶类，几乎能降解ECM的所有成分，已发现26种，按作用底物不同分为胶原酶、明胶酶、基质溶素、膜型基质金属蛋白酶等。而基质金属蛋白酶抑制因子（Tissue inhibitor of Matrixmetalloproteinase，TIMP）是近年发现的MMPs的天然抑制剂，迄今发现有4种，TIMP-1、2、4为可溶性分泌蛋白，TIMP-3是一种结合ECM的非可溶性蛋白。TIMP主要功能是通过对MMPs的抑制作用，调节ECM代谢，抑制新生血管生成，阻碍MMPs介导的内皮细胞移动，抑制基质中促血管生成因子的释放，防止ECM降解，在ECM改建和肝纤维化的病理过程中发挥重要作用。肝纤维化是肝脏对慢性持续性损伤的一种“愈合反应”，是纤维增生和降解不平衡的结果。其中心环节是使胶原纤维沉积增多、降解减少，而决定纤维合成—降解平衡的关键又在于MMPs与TIMP之间的调节失衡。肝脏在各种损伤性因素的始动作用下激活肝星形细胞（hepatic stellate cells，HSC），使HSC由静息细胞转变为移行细胞，然后转分化为肌成纤维样细胞，转化后其重要功能之一是使TIMP合成及分泌增加。TIMP-1从2个方面抑制MMPs活性：1)在酶原活化阶段，TIMP与MMPs可形成稳定复合体，阻碍MMP的酶原自我激活：2)在活化的酶原阶段，TIMP可直接与活化的MMPs形成1：1复合体，抑制其活性。肝组织中主要来源于HSC的TIMP-1，能结合除MMP-14、19以外的所有MMPs而减低其表达活性，特别是与能特异性分解Ⅰ、Ⅲ型胶原的间质胶原酶MMP-1的结合，使大量间质胶原及纤维连接蛋白（FN）取代Disse氏腔内Ⅴ、Ⅳ、Ⅵ、ⅩⅣ胶原成分，在基质重构形成Disse氏腔纤维化中起重要作用。抗肝纤维化研究，一方面积极抑制胶原过度产生，另一方面应设法促进肝窦周过度沉积ECM胶原纤维的降解，抑制TIMP-1的表达可释放MMPs对ECM胶原纤维的降解，改善肝纤维化结构，为阻止甚或逆转肝纤维化提供条件。比较现代基因抑制研究中反义寡聚核苷酸（antisenseoligonucleotides，ODNs）技术、核酶（ribozymes）技术、DNA酶（DNAzymes）技术、RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，以RNAi技术设计构建目的基因的小干扰RNA（smoll interference RNA，siRNA）抑制效果明显优于对应的单链反义RNA和反义DNA，抑制效果高出上百倍，并且siRNA在很低浓度即显示较高活性而没有毒性；剂量反应曲线显示siRNA的IC₅₀值比同一靶序列的反义寡核苷酸低100倍；RNAi高度特异性，siRNA中间位置单个碱基改变就可使RNAi失效，而针对同源基因共有序列的siRNA则导致同源基因共同失活：具有高度稳定性，siRNA在胎牛血清中的半衰期大约为24h，而反义寡核苷酸仅仅几分钟内就被降解。本课题利用RNAi技术设计TIMP-1的siRNA真核表达载体，以降解TIMP-1的mRNA，使TIMP-1在翻译过程中断，阻止其蛋白表达，解除对MMPs抑制。然而如何将所构建的TIMP-1 siRNA表达载体高效、安全转达肝组织并能在相应细胞中持续表达其抑制效果仍是所有基因治疗得以实现的关键问题。细胞膜是治疗基因进入细胞需要克服的屏障，其通透性改变是基因转染的前提。超声造影剂微泡技术研究并应用于临床，起初仅适用于超声诊断。新近研究发现，超声微泡表面所带负电荷能结合药物及基因大分子形成微泡—基因复合体。超声照射可使组织和体液内存在的微泡-基因复合体发生空化效应，使微泡破裂并释放所携基因药物。微泡破裂所形成的休克波使局部毛细血管通透性增加，并使细胞膜产生声孔（当声强为0.8W／cm-1.0W／cm时，用电子显微镜观察到内皮细胞膜出现缝隙），利于药物进入细胞间隙及细胞，实现目的基因在靶组织及细胞中的转染和表达。本课题应用RNAi技术构建抑制TIMP-1的真核表达载体TIMP-1 pRNAT-U6.2siRNA（TIMP-1 siRNA），并应用超声造影剂微泡技术携带TIMP-1 siRNA转染肝纤维化大鼠，观察其对大鼠血清学、肝组织结构形态学的影响，为肝纤维化基因治疗提供高效、特异基因及安全、有效基因转载途径。本实验分为以下四个部分。第一部分基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA真核表达载体的构建及鉴定方法1．根据siRNA设计原则，在TIMP-1 mRNA序列中选择2个特异性靶序列（447-465nt、552-540nt）及1条无关对照序列。2．体外合成对应发卡样DNA片段，将其克隆入pGEM-T连接载体，BamH I和Xho I分别双酶切pGEM-T及表达载体pRNAT-U6.2，胶回收粘末端将特异序列定向亚克隆构建TIMP-1 pRNAT-U6.2／siRNA真核表达质粒并测序3．Lentivirus病毒包装构建TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA慢病毒表达载体。4．用脂质体包裹TIMP-1 siRNA质粒、单纯慢病毒表达载体分别转染T6细胞，荧光显微镜观察TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA质粒及病毒载体在T6中表达，RT-PCR及FQ-PCR检测T6细胞TIMP-1 mRNA在TIMP-1 siRNA干扰下的表达水平。5．统计学处理：所有数据均经SPSS10.0软件进行统计分析。计量资料用采用（?）±S表示；两组均数的比较用t检验（t-test）；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）。结果1．所构建的TIMP-1 pRNAT-U6.2／siRNA表达质粒，经酶切鉴定与测序，结果显示特定位点靶序列与设计序列完全一致。2．Lentiverus病毒包装的TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA病毒表达载体滴度1.2～2.8x0^6-7IU／ml。3．慢病毒载体转染T6细胞较脂质体包裹质粒效率高，si-447序列较si-552序列沉默效应高，P＜0.05。4．转染T6细胞后，细胞TIMP-1 mRNA表达显著降低，si-447质粒沉默效率（78±8.72）％，si-552沉默效率（54.3±5.51）％；病毒表达载体si-447的沉默效率（81.3±7.61）％，si-552（66.3±8.37）％；si-C与T6细胞内TIMP-1 mRNA无显著差异，P＞0.05。第二部分建立肝纤维化大鼠模型方法1．SPF级雄性Wistar大鼠，体质量（150±10）g，1％二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）按10 mg／kg，腹腔内注射，第1周连续3次，第2、3、4、5、6周各连续2次；对照组同时间、同剂量生理盐水腹腔注射。2．第1次注药后第1、2、4、6、8各周随机取5只大鼠，取血及肝组织，Elisa方法测血清TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量；HE染色观察肝组织结构，按1995年肝纤维化分类标准鉴定；Masson染色观察肝组织胶原纤维含量，免疫组化检测肝组织内TIMP-1蛋白表达，原位杂交鉴定在肝组织内TIMP-1 mRNA表达。3．统计学处理：图像分析方法均采用病理分析仪高清晰图像处理系统，每张切片取四周及中央5个区域，每个区域均取阳性反应最多的视野，测定阳性反应面积百分比（阳性面积／肝组织面积x 100％），取平均值。采用SPSS 10.0统计软件，数值以均数±标准差（（?）±s）表示，采用t检验，方差分析比较不同组间数值差异显著性，P＜0.05有统计学意义。结果1．一般状况：模型组大鼠于注射DMN 16天后开始出现尿黄，进食和饮水减少；第32天始大鼠陆续出现目黄，好斗，皮毛皱而不洁，渐嗜睡；第45天始4只大鼠出现腹水，第8周时，均见臌胀腹水，2只死亡。2．造模大鼠血清TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ动态变化：注药一周，TIMP-1即开始升高，后持续增强，4周后维持高值；MMP-1含量2周处高峰，随后缓慢降低，8周时含量最低，然而仍高出正常对照组；HA含量注药后一周升幅达2倍，后持续增高，至6周时处高峰；LN注药后小幅增长至6周达高峰；CP-Ⅰ含量注药后1周始较对照组升高，6周处高峰；CP-Ⅲ含量用药后小幅升高，6周处于高峰。3．原位杂交及免疫组化评价肝组织内TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达及Masson染色观察肝胶原纤维含量：TIMP-1 mRNA及蛋白在肝纤维化造模早期1周时表达均增高，较对照组有显著性差异，P＜0.001；随用药次数及时间表达持续增高，6周、8周TIMP-1 mRNA呈高表达，但其两者差异不明显；肝胶原纤维百分含量4周前表达量较对照组虽有显著性差异，P＜0.05，但增幅不大；4周后，肝胶原纤维显著持续增高，8周时达：17.3±1.95。4．大鼠肝组织病理学变化：模型组大鼠用药后1周即可见肝细胞变性及小点状坏死灶，汇管区炎症，窦周及小叶内少量纤维沉积；2w时，部分小叶内点片状坏死灶，部分大鼠肝组织汇管区周围纤维沉积，纤维间隔形成；4 w时，大部分大鼠肝组织见肝细胞变性及融合坏死灶，纤维间隔伴小叶结构紊乱，符合肝纤维化3级，至6 w后停用DMN时，大鼠肝纤维化达到2～3级，大部分在3级，偶有4级片子；至8 w，所有大鼠肝纤维化达到3～4级，大部分4级。第三部分基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA真核表达载体转染肝纤维化大鼠对大鼠血清学、肝形态学的影响方法1．分组：造模成功大鼠分为TIMP-1 siRNA病毒载体组（T-si组：24只肝纤维化大鼠，20μl病毒载体＋200μl生理盐水），模型对照组（对照组：24只肝纤维化大鼠，220μl生理盐水），正常组(24只未经特殊处理Wister大鼠220μl生理盐水，以上药物均经大鼠阴茎静脉快速注射。注药后分别在2d、1w及2w处死，取血及肝组织（一部分4％多聚甲醛处理石蜡包埋，另部分-80℃冷冻切片y荧光纤维镜下观察及免疫组化等）。2．标本处理：双抗体夹心ABC-ELISA法测TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量（浓度：ng／ml）；HE染色观察肝组织结构及损伤分级；Masson染色测定肝组织胶原纤维含量；原位杂交、免疫组化法观察肝内TIMP-1 mRNA及蛋白分布；荧光显微镜下观察肝组织内TIMP-1 siRNA慢病毒表达载体肝组织内转染效率。3．统计学处理：图像分析方法均采用病理分析仪高清晰图像处理系统，每张切片取四周及中央5个区域，每个区域均取阳性反应最多的视野，测定阳性反应面积百分比（阳性面积／肝组织面积×100％），取平均值。采用SPSS 10.0统计软件，数值以均数±标准差（（?）±s）表示，采用t检验，方差分析比较不同组间数值差异显著性，P＜0.05有统计学意义。结果1．488 nm激发光荧光显微镜观察，507 nm的荧光照像，软件分析视野中绿色荧光强度值。2 d后，T-si组肝、肾、心肌组织切片中均有散在TIMP-1 siRNA慢病毒表达载体的绿色荧光表达，2．肝组织内免疫组化、原位杂交及Masson染色显示：2 d处死的大鼠肝组织胶原纤维、TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达均较造模组百分含量无显著性差异，P＞0.05；1 w后，肝组织TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达、胶原纤维含量均较造模组减低，P＜0.05；2 w后，肝组织TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达均较造模组减低，P＜0.05，肝组织内胶原纤维含量较第1 w组有显著性差异（P＜0.05），较造模组差异显著，P＜0.001。3．ELISA方法检测血清：2 d，TIMP-1、MMP-1及LN较对照组有显著性差异（P＜0.05），HA、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量较造模组差异不明显，P＞0.05；2 w，TIMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量均较对照组有显著降低，P＜0.001，MMP-1含量较对照组显著增高，P＜0.001；2 w后各参数改变较1w后有显著差异（P＜0.05），但幅度减缓。第四部分基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA在超声造影剂及超声辐照干预下对纤维化大鼠的影响方法1．超声造影剂及基因载体混合：SonoVue是单分子层磷脂外壳的六氟化硫粉末，额定生理盐水注入后形成亲水端朝外、疏水链在内的六面体结构微泡，平均直径2.5μm，浓度（1～5）×10⁸／ml。TIMP-1 siRNA及造影剂以1：10混匀，置4℃冰箱30 min，使2者混合充分。2．分组：TIMP-1 siRNA病毒组（Ⅴ组）：TIMP-1 siRNA 20μl＋200μl生理盐水：TIMP-1 siRNA病毒混合超声微泡组（V＋B组）：TIMP-1 siRNA 20μl＋200μl造影剂；TIMP-1 siRNA病毒混合超声微泡＋肝区超声辐照组（V＋B＋U组）：TIMP-1 siRNA 20μl＋200μl造影剂，同时机械指数（MI） 1.0超声辐照肝区5 min；造模对照组（C组）：220μl生理盐水，以上药物均经大鼠阴茎静脉快速注射。分别于2 d、1 w及2w后各组随机处理8只：取血、无菌取肝肾及心肌组织，两份保存，一份入4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片，另一份迅速冻存。3．标本处理：ELISA方法测TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量；各组织快冷冻切片，荧光显微镜观察组织内TIMP-1 siRNA的荧光表达；HE、Masson染色观察肝组织结构及胶原含量；提取肝组织总RNA，逆转录做荧光定量RT-PCR检测肝组织内TIMP-1 mRNA表达量。4．统计学处理：图像分析方法均采用病理分析仪高清晰图像处理系统，每张切片取四周及中央5个区域，每个区域均取阳性反应最多的视野，测定阳性反应面积百分比（阳性面积／肝组织面积x 100％），取平均值。采用SPSS 10.0统计软件，数值以均数±标准差（（?）±s）表示，采用t检验，方差分析比较不同组间数值差异显著性，P＜0.05有统计学意义。结果1．转染2 d后，V＋B＋U组肝组织内TIMP-1 siRNA绿色荧光表达量显著高于其它各组（P＜0.001），V组、V＋B组各组织见散在绿色TIMP-1 siRNA表达，组间差异不明显（P＞0.05）；V＋B＋U组可见荧光表达呈树枝状强化。2．肝组织内胶原纤维含量：用药后2d，V＋B＋U组TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白及肝内胶原纤维含量均有降低，较对照组差异显著，P＜0.05；V组及V＋B组较对照组差异不明显，P＞0.05；1w及2w后，V＋B＋U组TIMP-1mRNA及蛋白、胶原纤维含量减低，均较对照组及V组、V＋B组差异显著（P均＜0.001），V组、V＋B组组间差异不明显（P＞0.05）。3．ELISA方法检测测大鼠血清显示：2d时，V组、V＋B组各测值除TIMP-1 MRNA较对照组减低外（P＜0.05），其余各测值均较对照组无显著差异，P＞0.05；V＋B＋U组MMP-1较对照组显著增高，余测值均较对照组减低，差异显著（P均＜0.05）；1w及2w后，V＋B＋U组各测值均较对照组及V组、V＋B组差异显著（P均＜0.001），V组、V＋B组各测值组间无显著差异（P均＞0.05）。4．FQ-PCR检测肝组织内TIMP-1 mRNA表达量：1w后，V＋B＋U组对TIMP-1mRNA抑制效率为73.1％，V＋B组及V组抑制效率分别为47.1％，40.3％；2 w后，V＋B＋U组抑制效率为85.5％，V组抑制效率为68.4％，V＋B组抑制效率为66.4％。结论1．成功筛选构建了TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA真核表达质粒及Lentivirus病毒包装的TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA慢病毒表达载体。2．首次将TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA质粒及TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA／LentisiRNA慢病毒载体转染肝星形细胞（T6），鉴定其对TIMP-1表达的沉默效应，TIMP-1基因447-470bp做为siRNA插入序列的表达载体沉默效应最显著。3．应用肝毒性药物DMN成功建立大鼠肝纤维化模型，系统观察造模各时期肝组织结构形态学变化及血清学相关指标的改变，为研究肝纤维化病理及治疗肝纤维化提供实验依据。4．首次将TIMP-1 siRNA静脉注射于活体肝纤维化大鼠体内，在体抑制TIMP-1表达显著，血清MMP-1含量增高，TIMP-1及HA、CP-1等相关肝纤维指标降低，纤维化肝组织内胶原纤维含量减少、肝组织结构有一定改善。5．首次应用超声造影剂混合TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA共同输注肝纤维化大鼠体内，应用高机械指数超声辐照肝组织，使TIMP-1 pRNAT-U6.2／LentisiRNA表达载体在肝脏高浓度表达，起到将目的基因定位释放于肝组织作用，为安全、靶向基因治疗肝纤维化提供有效转载途径。本项目的特色与创新之处：（1）肝星形细胞（HSC）激活是肝细胞外基质过度沉积形成肝纤维化的基础，而基质金属蛋白酶及其抑制因子的调节失衡是核心，以往研究多在抑制肝星形细胞的激活，而肝星形细胞的激活呈多因素，难以充分抑制。本课题针对核心中基质金属蛋白酶抑制因子-1，应用基因抑制先进的RNA干扰技术及新的pRNAT-U6.2／Lenti表达载体系统，首次将其应用在肝纤维化研究中，为肝纤维化基因治疗提供有效靶基因及工具。（2）首次将TIMP-1小干扰RNA表达载体应用超声造影剂携带，在高机械指数超声辐照条件下探索将目的基因定向释放于靶器官肝组织的的方法，提高基因转染效率、减低基因对非目的器官干扰，为肝纤维化基因治疗提供高效、安全转运途径。