论文部分内容阅读
miRNA是一类长约20~24 nt的非编码单链小分子RNA,是基因表达的重要调控因子,参与生物体内几乎任何一种已知的生理和病理过程,研究其合成的调控机制具有重要的意义。Drosha是一个核定位的RNase III,在细胞核中可与DGCR8形成microprocessor,参与micro RNA的合成。序列分析发现,Drosha的N端存在一个潜在的RS-rich功能域,可能是SR蛋白特异性激酶SRPK1的底物。SRPK蛋白家族是一类特殊的丝氨酸/苏氨酸激酶,目前在动物中发现SRPK1和SRPK2两个成员,可以在细胞质中渐进性的磷酸化SR蛋白的RS-rich功能域,在m RNA剪接中起重要调控作用。早期的实验表明,SRPK1可被Drosha免疫共沉淀下来,表明二者可能存在于同一个复合物中;我们实验室前期的工作发现SRPK1在体内可以与Drosha互作;而Phospho Site Plus数据库中大规模的质谱分析结果表明,Drosha N端的RS-rich domain中存在多个磷酸化位点。综合这些结果,我们认为小鼠中SRPK1可能作为潜在的蛋白激酶直接磷酸化Drosha。本文旨在通过确认SRPK1对Drosha的磷酸化,找到可能的磷酸化位点,证明它们对于mi RNA合成的重要性,并进一步探讨SRPK1介导的Drosha磷酸化水平的变化影响其功能的可能分子机制。这些对于我们理解mi RNA合成的机理及调控机制有着重要的意义。首先,我们通过体外的磷酸激酶实验确认了SRPK1可以直接磷酸化Drosha。我们将His-tag的Drosha和SRPK1分别在大肠杆菌中诱导表达后,进行蛋白纯化。然后利用纯化的Drosha和SRPK1进行体外的磷酸化激酶实验,确认了SRPK1在体外可以磷酸化Drosha。在确认了SRPK1可以磷酸化Drosha后,我们又对的磷酸激酶实验后的Drosha进行了质谱分析,找到了四个磷酸化位点:S201,S237,S300和S302,它们全部位于Drosha的RS-rich domain中。我们将这些磷酸化位点分别进行了S-A突变,并再次在大肠杆菌中过量表达和纯化这些kinase-dead突变体,体外的激酶实验显示突变后Drosha的磷酸化水平明显降低(结果未在次论文中公开)。通过这些实验,我们证明SRPK1可以作为Drosha的激酶,在体外直接磷酸化其RS-rich结构域。随后,为证明SRPK1可以影响mi RNA的生物合成,我们进行了基因组水平上的mi RNA profiling。我们分别从野生型和SRPK1敲除的MEF细胞中提取总RNA,构建mi RNA文库,进行高通量测序并将结果与mi RBASE数据库进行比对。结果显示,在我们检测到的239个mi RNA中有36个mi RNA的表达量在SRPK1敲除后发生了显著的变化:23个下降的,13个上调的。随后进行的定量PCR验证了mi RNA profiling的可靠性。综合这些实验结果,我们证明了在MEF细胞中敲除SRPK1可以影响其mi RNA的水平,即SRPK1可以影响mi RNA的生物合成,我们推测这种影响是通过Drosha完成的。最后,我们探讨了SRPK1影响mi RNA生物合成的可能机制。研究表明,SR蛋白的磷酸化水平与其亚细胞定位密切相关,低水平磷酸化的SR蛋白会滞留在细胞质中,无法参与m RNA剪接,因此我们首先验证SRPK1介导的Drosha磷酸化水平的改变是否影响其亚细胞定位。我们利用RNAi在294T细胞内敲低SRPK1的表达,随后在细胞内表达GFP-tag的野生型Drosha或其去磷酸突变体,进行免疫荧光实验。实验证明,当SRPK1 knock down或Drosha的磷酸化位点发生突变后,Drosha的亚细胞定位发生了变化,由细胞核中弥散到细胞质中。此外,SR蛋白的RS-rich domain与其蛋白互作有关,因此,我们也验证了SRPK1对Drosha磷酸化的改变是否会影响到Drosha与DGCR8的互作,进而影响其功能。我们在SRPK1敲低的293T细胞中表达GFP-tag的Drosha的磷酸化突变体,通过免疫共沉淀实验证明了Drosha S221,S237,S300,S302四个磷酸化位点突变后,Drosha与DGCR8的互作明显降低(结果未在次论文中公开)。本论文的结果证明了小鼠中SRPK1可以直接磷酸化Drosha,并找到了4个可能的磷酸化位点,证明了它们对于mi RNA合成的重要性;同时,初步探讨了SRPK1影响mi RNA合成的可能机制,证明了SRPK1可以影响Drosha的亚细胞定位及与DGCR8的互作。SRPK1是m RNA剪切以及细胞信号转导中的重要激酶之一,找到其影响mi RNA合成的可能机制有助于加深我们在调控mi RNA水平方面的研究,找到mi RNA失调的致病机理,有着重要的理论和临床应用价值。