【摘 要】
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在自然环境中,植物的生长发育受到各种生物胁迫和非生物胁迫的影响。为了适应环境,植物可以通过分子水平和生理水平的应答机制来抵御外界的伤害。其中基因的特异性表达途径是转录因子（TFs）与顺式作用元件相互作用,使响应环境胁迫的相关基因特异性表达,以维持植物的正常生命活动。本研究从甜高粱中分离了Sbb HLH85基因,分析该基因的生物信息,构建表达载体进行亚细胞定位分析。获得该基因的过表达纯合株系、Atb
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在自然环境中,植物的生长发育受到各种生物胁迫和非生物胁迫的影响。为了适应环境,植物可以通过分子水平和生理水平的应答机制来抵御外界的伤害。其中基因的特异性表达途径是转录因子（TFs）与顺式作用元件相互作用,使响应环境胁迫的相关基因特异性表达,以维持植物的正常生命活动。本研究从甜高粱中分离了Sbb HLH85基因,分析该基因的生物信息,构建表达载体进行亚细胞定位分析。获得该基因的过表达纯合株系、Atb HLH85突变体纯合株系,通过测定野生型、突变体、过表达株系的生理以及分子指标,初步阐明Sbb HLH85基因在盐胁迫条件下的功能。主要实验及结论如下:1、对Sbb HLH85基因克隆并进行生物信息学分析可知,甜高粱b HLH85基因共有编码序列951 bp,编码316个氨基酸,具有典型的HLH保守结构域,属于b HLH家族成员。Sbb HLH85编码的蛋白是不稳定蛋白,没有跨膜结构螺旋区,没有信号肽,是分泌到细胞外的成熟的亲水蛋白。通过对目的蛋白与其他物种中的同源蛋白序列进行比对,发现其与日本稻的同源性最高,亲缘关系最近。2、构建Sbb HLH85基因的克隆载体、表达载体以及转化到农杆菌细胞中,通过烟草瞬时转化的方法证明该基因在细胞核中表达。3、转化野生型拟南芥得到过表达植株,进而利用抗生素筛选以及分子水平上的鉴定获得过表达纯合株系。通过荧光定量PCR技术选择出表达量最高和表达量一般的过表达株系OX4和OX13。从Tair网站购买Atb HLH85突变体种子,利用二引物法进行鉴定,并获得突变体纯合株系,通过荧光定量PCR技术鉴定基因表达量,并选择表达量较低的rsl2-1和rsl2-3进行下一步的实验。4、用0、50、100、150、200 m M Na Cl处理甜高粱耐盐自交系M81-E和野生型拟南芥,分别进行该基因表达量的分析。在盐胁迫条件下,甜高粱中该基因的表达量均降低,在100 m M Na Cl时表达量最低。该基因在野生型拟南芥的根和叶中的表达量均降低,并且随着盐浓度的升高而降低。5、用0、100、150 m M Na Cl处理野生型拟南芥（WT）、过表达株系（OX4、OX13）和突变体株系（rsl2-1、rsl2-3）,对其萌发期的生理指标进行测定。通过萌发期实验我们发现,突变体株系的萌发率和根长要好于野生型和过表达株系。通过对不同胁迫下各个株系的萌发率和根长的测定可知,植物萌发期在盐胁迫条件下主要受到了渗透胁迫。6、用0、100 m M Na Cl处理野生型拟南芥（WT）、过表达株系（OX4、OX13）和突变体株系（rsl2-1、rsl2-3）,对其苗期生理指标进行测定。在生物量方面,盐胁迫下突变体株系要高于野生型拟南芥,过表达株系要低于野生型拟南芥。通过对各个株系进行DAB和NBT染色实验,我们观察到过表达株系中的活性氧物质积累较多,而突变体中的积累较少。对各个株系的MDA含量进行测定,结果表明在突变体中MDA含量少于野生型和过表达株系。此外,我们还对盐胁迫相关基因的表达进行了分析,与离子胁迫（SOS1、NHX1、HKT1、CLCc）、渗透胁迫（P5CS1）、氧化胁迫（APX、SOD）相关基因的表达量都是突变体株系高于野生型和过表达株系。综上,我们可以推测出Sbb HLH85在盐胁迫条件下呈现负调控的作用。7、通过对野生型拟南芥（WT）、过表达拟南芥（OX4、OX13）、突变体株系（rsl2-1、rsl2-3）以及RSL2的功能冗余基因RSL4突变体（rsl4）和双突变体（rsl2rsl4）在萌发期根毛的观察可知,过表达株系的根毛数量最多,根毛长度比野生型拟南芥和单突变体株系长,在双突变体中出现了无根毛的现象。由此我们推测,根毛生长状况与植物的抗盐能力密切相关。在盐胁迫条件下由于根毛数量和长度的增加,导致植物从环境中吸收的离子增多,造成的毒害更加严重,从而抗盐能力下降。综上所述,甜高粱b HLH85基因在植物的抗盐过程中,起着负调控的作用。
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